《Free Radical Biology and Medicine》：Inhibition of Endothelial ALOX12 Mitigates Cerebral Ischemia–Reperfusion Injury by Suppressing 12-HETE
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本研究通过单细胞转录组和代谢组学分析，揭示脑缺血再灌注损伤中内皮细胞ALOX12-12-HETE轴的作用，证实其通过破坏血脑屏障、促进炎症和氧化应激加剧神经血管损伤，抑制该通路可改善预后。临床数据显示血浆12-HETE水平与卒中严重程度正相关。
陶王|张久宇|卢光远|韩大海|米婷|马霞|王璐|何振权|牛建国
宁夏医科大学基础医学院人体解剖学系，宁夏基础医学研究中心，银川，750000，中国
摘要
在急性缺血性中风（AIS）中，再灌注疗法的效果受到脑缺血-再灌注（I/R）损伤的限制，其中内皮功能障碍和血管分泌脂质介质驱动血脑屏障（BBB）破坏、神经炎症和氧化应激。在这些介质中，ALOX12衍生的12-HETE被认为是一个关键效应因子，但其细胞来源及其在脑I/R中的下游影响尚未完全明确。在这项研究中，我们结合了单细胞RNA测序和非靶向代谢组学，并在小鼠短暂性中脑动脉阻塞（tMCAO）模型和基于OGD/R的细胞系统中进行了机制验证，以确定脑I/R后ALOX12–12-HETE的失调情况。通过微血管-脑实质分离、选择性ALOX12抑制剂ML355以及内皮靶向的AAV-BR1介导的Alox12敲低实验，进一步评估了内皮的定位和功能贡献。同时，在倾向评分匹配的AIS患者和健康对照组中测量了血浆12-HETE水平。单细胞分析表明，内皮细胞是I/R后ALOX12诱导的主要部位，伴随12-HETE的积累增加。功能上，12-HETE作为一种有害的血管分泌介质，损害了内皮紧密连接完整性，促进了促炎性小胶质细胞的激活，并加剧了神经元氧化损伤，表现为线粒体ROS积累、抗氧化剂耗竭和细胞凋亡。用ML355药理学抑制ALOX12可以减轻神经血管损伤，改善生存率，并恢复氧化还原平衡，而内皮靶向的Alox12敲低也产生了类似的保护效果。在信号传导层面，ML355与KEAP1表达降低、NRF2核积累增强和HO-1表达增加相关，这与部分抗氧化信号传导的恢复一致。临床数据显示，AIS患者的血浆12-HETE水平显著升高，并与中风严重程度（NIHSS）呈正相关。综上所述，这些发现支持内皮ALOX12–12-HETE信号通路是脑I/R后多细胞神经血管损伤的氧化还原活性血管分泌途径，并强调了抑制ALOX12作为潜在治疗策略的可行性。
引言
急性缺血性中风（AIS）是一种主要的脑血管疾病，由脑血流突然中断引起，导致急性局部神经功能缺损[1]。尽管急性中风护理取得了进展，AIS仍然是全球死亡和长期残疾的主要原因[2]、[3]。目前的基于证据的再灌注策略，包括使用重组组织型纤溶酶原激活剂（r-tPA）的静脉溶栓和血管内机械取栓术，可以有效恢复脑灌注[4]、[5]。然而，仍有相当比例的患者在再灌注后未能获得良好的恢复[6]，临床益处往往受到脑缺血-再灌注（I/R）相关神经血管损伤的限制[7]。这些观察结果表明，AIS的病理生理学不仅由血管阻塞本身决定，还受到复杂的细胞网络中继损伤反应的影响[8]。
这个网络中的核心枢纽是血脑屏障（BBB），它作为循环系统与脑实质之间的关键接口，是AIS后最早受损的目标之一。脑I/R会破坏内皮紧密连接（TJs），使血浆成分和水渗入脑实质，从而促进血管源性水肿和继发性组织损伤[9]、[10]。屏障破坏还会迅速激活先天性的神经免疫反应，因为小胶质细胞、星形胶质细胞和周细胞释放促炎性细胞因子和趋化因子，放大炎症级联反应并加重神经元损伤[11]、[12]。因此，BBB破坏不仅是脑I/R的早期病理标志，还是驱动下游神经血管损伤程序的上游事件[13]、[14]。重要的是，内皮细胞作为BBB的主要细胞成分，还通过旁分泌和接触依赖性信号传导调节中风后的炎症、组织修复和神经再生[15]、[16]。
与这种多细胞应激反应一致，临床代谢组学研究揭示了AIS患者循环代谢组的广泛重塑，包括甘油磷脂和鞘脂代谢、支链氨基酸和色氨酸-犬尿氨酸代谢等氨基酸途径以及与能量/氧化还原相关的模块（如乳酸-丙酮酸平衡和谷胱甘肽/NADPH相关特征）的反复变化[17]。在这种代谢背景下，膜磷脂衍生的脂质介质越来越被认为是将缺血应激转化为神经血管功能障碍的快速效应系统[18]。在病理条件下，内皮分泌产物倾向于释放生物活性脂质介质，将屏障不稳定性与炎症放大和氧化还原失衡联系起来，从而形成一个加速神经元损伤的正反馈循环[19]、[20]。
在这些脂质介质途径中，花生四烯酸（AA）是一种主要的ω-6多不饱和脂肪酸，酯化在膜磷脂中，在细胞应激期间被释放[21]。在缺血或炎症刺激下，AA通过脂氧合酶（LOX）途径代谢生成生物活性二十烷酸类物质，调节炎症、免疫信号传导和血管稳态[22]、[23]。ALOX12（12-LOX）催化AA转化为12(S)-羟基二十碳四烯酸[12(S)-HpETE]，随后被谷胱甘肽过氧化物酶（GPxs）还原为12(S)-羟基二十碳四烯酸[12(S)-HETE][24]。特别是，内皮应激可能通过ALOX12–12-HETE途径作为血管分泌信号通路，促进ROS相关的氧化还原失衡、紧密连接完整性的破坏以及神经血管单元内的继发性炎症损伤的放大[25]、[26]。
尽管ALOX12已被证实与多种病理状况有关，包括心肌、肝脏和肾脏的I/R损伤以及糖尿病[27]，但其细胞类型特异性诱导、时间动态及其在AIS中的功能相关性仍不完全清楚。在本研究中，我们试图通过将其激活与BBB破坏、炎症放大和氧化还原失衡联系起来，来定义内皮ALOX12–12-HETE轴作为脑I/R后神经血管损伤的机制相关介质。我们进一步测试了抑制ALOX12是否可以减轻神经血管损伤并改善功能结果。同时，我们评估了循环中的12-HETE是否与疾病严重程度相关，以及它是否可以作为AIS的外周标志物候选物。
部分内容
伦理和研究对象
人类研究得到了延安大学附属医院伦理委员会的批准，并遵循赫尔辛基宣言进行。动物实验得到了宁夏医科大学机构动物护理和使用委员会的批准，符合ARRIVE 2.0和NIH指南。
我们最初招募了50名连续的AIS患者（症状出现后24小时内通过DWI-MRI确认）和80名健康对照组。诊断由经验丰富的
单细胞转录组学确定内皮细胞是脑I/R后ALOX12诱导的主要部位
为了定义脑I/R后的细胞类型特异性转录反应，我们分析了来自假手术和tMCAO小鼠大脑的公共scRNA-seq数据集。无监督聚类根据典型标记物表达识别出11个不同的细胞群（图1A,B）。细胞组成分析显示整个神经血管单元发生了广泛的变化，其中内皮细胞的变化最为显著（图1C）。内皮细胞内的差异表达分析显示
讨论
在这项研究中，我们确定内皮ALOX12–12-HETE轴是脑I/R损伤的血管分泌贡献者。通过整合单细胞转录组学和代谢组学，我们发现内皮细胞是I/R后ALOX12诱导的主要细胞类型，这与血浆和I/R脑组织中12-HETE的病理积累相一致。功能上，我们的数据支持12-HETE作为一种有害的血管分泌脂质信号分子，它在多细胞中传播功能障碍
结论
通过整合单细胞转录组学、代谢组学和功能验证，本研究表明内皮ALOX12–12-HETE轴促进了脑I/R损伤的发展。用ML355进行药理学抑制和内皮靶向的Alox12敲低一致降低了12-HETE水平，减轻了氧化应激，保持了血脑屏障的完整性，并改善了功能结果。此外，循环中的12-HETE与中风严重程度相关，支持
CRediT作者贡献声明
牛建国：写作 – 审稿与编辑、可视化、监督、资金获取。陶王：写作 – 原稿撰写、正式分析、数据管理、概念构思。卢光远：可视化、监督。张久宇：方法学、研究。米婷：方法学。韩大海：研究。王璐：可视化。马霞：方法学。何振权：项目管理、方法学、研究、资金获取
伦理声明
本研究严格遵循赫尔辛基宣言进行。人类研究方案得到了延安大学附属医院伦理委员会的批准（批准编号IIT-R-20250103），并且所有参与者都获得了知情同意。所有动物实验都得到了宁夏医科大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号IACUC-NYLAC-2024170）。
数据共享声明
由于隐私和伦理限制，本研究中生成和/或分析的数据集不对外公开，但可根据合理请求从相应作者处获取。
利益冲突声明
作者声明没有可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
数据可用性声明
本研究中生成和/或分析的数据集可根据合理请求从相应作者处获取。资助
本研究得到了宁夏医科大学的校级科学研究项目（XT2025033、XZ2022009）；宁夏自然科学基金（2023AAC03197）；国家自然科学基金（32460200、32560195）；宁夏重点研发计划（2023BEG03009、2024BEG02027）；宁夏回族自治区人才计划（2023GKLRLX16、2024BEH04107）；以及大学生创新和创业培训计划的支持利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的工作。致谢
作者感谢王俊丽教授在语言润色方面的帮助，以及荣伟芳教授提供的深刻讨论和宝贵建议。
