优势三化性家蚕（Bombyx mori）蜕皮变异的转录组分析

《Gene》：Transcriptome analysis of molting variation in dominant trimolter silkworms, Bombyx mori

本研究以稳定三蜕皮家蚕‘广日3’品系为材料，在春（25℃）秋（30℃）季自然条件下饲养，通过RNA-seq和生物信息学分析，发现秋季环境显著增加四蜕皮变体发生率，并鉴定出与蜕皮相关通路（如壳质分解代谢）及关键基因（如CYP、CPR、Rp等），为家蚕高效育种提供理论依据。

　　

徐丽山|严帆|杨世军|杨涵|王新玲|张志勇|刘俊峰|王勤

四川农业大学生命科学学院，雅安625014，中国

摘要

家蚕（Bombyx mori）是一种全变态昆虫，对丝绸生产具有重要的经济价值。由于具有更细的丝纤维、更短的幼虫发育期以及更低的劳动力投入，三化蚕在养蚕业中引起了极大的关注。这些特性使得三化蚕适合用于多种类型的生丝生产。然而，某些来自同一三化蚕品系的个体可能会经历额外的蜕皮，从而变成四化蚕。这一变化的原因尚不清楚，因此成为了本研究的重点。具体来说，我们研究了‘Guangri 3’这一稳定的二化三化蚕品系，其中部分个体偶尔会出现额外的蜕皮现象。在本研究中，‘Guangri 3’三化蚕分别在春季（25°C，A组）和秋季（30°C，B组）的自然条件下进行饲养。A组包括正常的三化蚕（TA）和四化蚕变体（FA），而B组包括正常的三化蚕（TB）和四化蚕变体（FB）。统计分析显示，FA组的变异发生率为1.10%，FB组的变异发生率为16.10%。随后对这些组进行了RNA-seq分析。结果表明，在FA与TA的比较中，有1044个基因上调，846个基因下调；而在FB与TB的比较中，有808个基因上调，707个基因下调。GO和KEGG富集分析显示，上调和下调基因涉及与昆虫蜕皮相关的通路，如几丁质代谢。通过分析这些基因的交集，我们确定了17个持续上调的基因和22个持续下调的基因作为高优先级候选基因。在这些通路中，识别出多个关键基因家族，包括CYP、CPR和Rp。此外，通过对FB与TB比较中的基因进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，还发现了潜在的关键基因，如Hsp83。这些基因在秋季饲养条件下的蜕皮变化中的潜在作用值得进一步研究。

引言

家蚕（Bombyx mori）（鳞翅目：蚕科）是一种驯化的昆虫，能够生产丝绸这种天然蛋白质纤维（Ou等人，2025年）。这种材料不仅对丝绸生产具有重要的经济价值（郭红等人，2018年），还广泛应用于科学研究和工程领域，例如临床试验以及电子和光学设备中（Chand等人，2023年）。随着家蚕基因组测序的完成，家蚕的功能基因组学已成为研究热点，特别是关注其发育相关方面，如蜕皮行为、化性、性别决定和繁殖（Tong等人，2022年）。其中，幼虫的蜕皮行为与主要经济性状密切相关，包括茧产量和丝纤维的细度，因此受到了广泛关注（张等人，2021年）。在本研究中，三化蚕指的是经历三次蜕皮的蚕（完成四个幼虫期），而四化蚕则经历四次蜕皮（完成五个幼虫期）。

在家蚕蜕皮过程中起关键作用的两种重要激素是20-羟基蜕皮酮（20E）和幼虫激素（JH），它们分别由位于头部-胸部交界处的前胸腺（PG）和体腺（CA）分泌（Bian等人，2022年）。昆虫的生长、发育和蜕皮依赖于20E的浓度（Gilbert和Warren，2005年）。同时，Cai等人证实JH在防止幼虫过早成熟、维持幼虫状态、控制成虫性发育和促进卵成熟方面起着关键作用（Cai等人，2022年）。具体而言，20E与EcR（蜕皮酮受体）-Usp（气门蛋白）异二聚体结合，依次激活早期基因（如E75、E74、E93）和晚期基因（如HR3、HR4）。这一信号最终通过βFTZ-F1级联反应放大，以调节晚期基因的表达（Bonneton等人，2008年）。因此，20E参与了蜕皮过程。JH主要由JH-Met-Kr-h1-Br信号轴调控，其中Kr-h1和Br是关键基因。Kr-h1表达的降低会促进Br的表达，从而加速化蛹过程（Konopova和Jindra，2008年）。相反，外源JH类似物的应用会抑制Br的表达，从而阻止化蛹（Zhou和Riddiford，2001年）。此外，JH还通过Met调控Kr-h1的转录，进而影响Br的表达（Konopova和Jindra，2008年）。此外，自噬和凋亡是昆虫幼虫组织降解的重要过程（Tian等人，2010年）。在家蚕中，20E调控下的早期响应转录因子（Br-C、E74、E75和E93）在自噬调节中起关键作用。值得注意的是，Bombyx E75被认为在幼虫向蛹的转变过程中诱导自噬至关重要（Lin等人，2023年），而E93也在转录水平上调节20E信号，促进幼虫向蛹的发育（Liu等人，2015年）。总之，20E浓度的升高会促使表皮细胞与旧角质层分离并形成新的角质层；随后，20E浓度降至蜕皮前的水平，启动蜕皮过程。在此过程中，体腺分泌JH，通过抑制与发育相关的基因来维持幼虫状态（Kataoka等人，1991年）。因此，这两种激素以拮抗的方式调节昆虫的蜕皮过程（Zhang等人，2019年）。

作为小型变温动物，昆虫的生物表现受到环境温度的显著影响（Colinet等人，2015年）。因此，家蚕的蜕皮行为不仅受内源性激素的调控，还受外部环境因素的影响，如温度、相对湿度、通风和桑叶（Torres McCook等人，2021年）。例如，将五龄幼虫暴露在28°C下会缩短其幼虫发育期（Kim等人，2011年）。此外，Gowda等人让三种家蚕品系经历温度和湿度胁迫，实验结果表明高温和高湿度对幼虫生长和茧质量有显著的负面影响。这进一步表明家蚕对温度波动非常敏感（Gowda和Reddy，2007年）。

目前，关于家蚕蜕皮、茧及其工业应用的研究主要集中在四化蚕上（Lima等人，2023年；Lopes等人，2023年）。由于许多应用需要细丝纤维，因此使家蚕幼虫产生细旦丝是有利的。研究表明，三化蚕形成的茧更为紧密，其丝纤维直径更小。此外，三化蚕的丝纤维具有更多的β-折叠结构，从而显著提高了细丝的强度和杨氏模量（刚性），增强了三化蚕丝的机械性能。尽管三化蚕产丝量较少，但其生长周期较短，且三化蚕生丝的市场价格比四化蚕高出70%（郭坤等人，2018年）。为了满足高端丝绸和生物医学工程对细桑丝的需求，这些特性，采用了两种方法来培育三化蚕品系。首先，使用化学方法（如激素诱导）来生成具有这些特性的三化蚕品系。例如，Niu等人通过使用抗幼虫激素（AJH）成功将四化蚕转化为三化蚕（Niu等人，2013年）。其次，传统的育种方法结合杂交和系谱选择及选育，培育出了具有稳定蜕皮行为的品系，如“SG”（Yiyuan和Simei，1997年）。然而，在实际生产中，单一的三化蚕品种可能会出现蜕皮频率增加的情况，从而导致四化蚕的出现。这对饲养管理带来了挑战，并造成了养蚕业的经济损失。此外，关于自然饲养条件下三化蚕品系蜕皮性状变异原因的研究仍然很少，其背后的调控机制也不清楚。这严重影响了三化蚕品系的育种及其遗传资源的保护。

因此，本研究旨在筛选在自然季节条件下饲养的家蚕中调控蜕皮行为的关键转录因子。使用稳定的三化蚕品系‘Guangri 3’作为实验材料，我们观察了春季（25°C）和秋季（30°C）饲养条件下的蜕皮行为变化，并通过转录组测序（RNA-seq）、生物信息学分析和qPCR验证进行了研究。研究目的是识别与蜕皮行为相关通路中富集的主要功能基因，阐明蜕皮行为变化的分子基础，并最终为三化蚕的育种和提高生产效率提供科学参考。

节选内容

家蚕品系和样本收集

本研究中使用的具有稳定蜕皮行为的三化蚕品系‘Guangri 3’是由‘7532 White’和‘Xiang 43 White’杂交得到的。蚕卵由四川省农业科学院蚕业研究所提供，并确保由同一批雌蛾产下。它们的孵化和饲养在遂宁市该研究所的设施中进行。孵化过程由CYS11型智能设备控制

蜕皮行为特征调查

根据2.1节中描述的鉴定标准，对6个独立的饲养批次（重复实验）的春季和秋季饲养组进行了蜕皮行为特征的统计分析。在标准的春季饲养条件（25°C）下，四化蚕的平均发生率较低：在总共1539只幼虫中，只有17只是四化蚕，平均发生率为1.10%。相比之下，在秋季饲养条件（30°C）下，有251只是四化蚕

讨论

家蚕是一种经济上重要的昆虫，其蜕皮行为与关键经济性状密切相关，包括茧产量、丝质和丝纤维的细度（张等人，2021年）。一般来说，家蚕的幼虫期数是遗传固定的，但也受到环境和遗传信号的双重影响（郭等人，2018年；钱和徐，2006年）。为了研究自然饲养条件下三化蚕品系蜕皮行为变化的原因，本研究采用了

结论

总之，本研究表明，在‘Guangri 3’三化蚕品系中，秋季饲养条件与四化蚕变体的发生率增加密切相关。RNA测序技术用于识别参与调控家蚕蜕皮行为的关键基因，在不同季节条件下的组间鉴定出了大量差异表达基因（DEGs）。随后的生物信息学分析，包括GO、KEGG和PPI网络分析，突出了几个高优先级的基因

伦理声明

本研究中涉及家蚕的所有实验程序均严格遵循四川农业大学动物伦理委员会批准的动物福利和使用指南（批准编号SKY-2023216010）。在收集组织样本之前，通过立即浸入液氮进行快速冷冻以实现安乐死，以尽量减少潜在的痛苦和不适。

CRediT作者贡献声明

徐丽山：撰写——初稿、可视化、方法学、调查、数据分析、数据管理。严帆：验证、方法学、调查、数据管理。杨世军：撰写——审稿与编辑、软件应用、方法学。杨涵：软件应用、方法学。王新玲：软件应用。张志勇：监督、资源提供。刘俊峰：监督、资源提供。王勤：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、调查、资金争取，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了四川省科技厅应用基础项目（2022NSFSC0122）的支持。我们非常感谢四川省农业科学院蚕业研究所的育种工作，同时也感谢四川大学的Martinson Ankrah Twumasi博士对本文语言的修改工作。