m5C修饰的circSMAD2通过AKT/mTOR双轴驱动胰腺癌进展：ceRNA与分子支架的双重机制及诊疗潜力

《Genes & Diseases》：5-Methylcytidine (m5C)-modified circSMAD2 promotes pancreatic cancer progression via the AKT/mTOR pathway

针对胰腺癌（PC）早期诊断难、预后差且分子机制不清的问题，研究团队聚焦m5C修饰的环状RNA（circRNA），揭示circSMAD2通过竞争性内源性RNA（ceRNA）机制吸附miR-769-5p，上调TRIM59激活AKT/mTOR通路；同时作为分子支架促进IGF2BP1与TPT1 mRNA结合，增强TPT1稳定性，双轴协同驱动肿瘤进展。该研究首次阐明circSMAD2的致癌机制，为其作为诊断标志物和治疗靶点提供依据。

　　

胰腺癌被称为“癌中之王”，五年生存率不足10%，多数患者确诊时已属晚期，手术切除率低且化疗易耐药。尽管已知遗传与表观遗传改变参与发病，但关键分子机制仍不明确。环状RNA（circRNA）作为共价闭合的非编码RNA，具有组织特异性、高稳定性等优势，近年被发现可通过吸附microRNA（miRNA）、调控可变剪接及介导N6-甲基腺苷（m⁶A）修饰等参与肿瘤进展，但在胰腺癌中的作用研究极少。此外，5-甲基胞苷（m⁵C）修饰虽被证实可调控癌基因RNA稳定性，但其在circRNA中的功能尚未探索。在此背景下，上海瑞金医院团队开展了m⁵C修饰的circSMAD2在胰腺癌中的功能与机制研究，相关成果发表于《Genes》。

研究采用的关键技术方法包括：临床样本队列（瑞金医院60对胰腺癌及癌旁组织、75对组织芯片），细胞系（AsPC-1、BxPC-3等6种胰腺癌细胞系及HPNE正常细胞），亚细胞分离与荧光原位杂交（FISH）定位circSMAD2，RNA免疫沉淀（RIP）验证RNA-蛋白相互作用，双荧光素酶报告基因验证ceRNA及RNA-RNA结合，RNA pulldown联合质谱鉴定互作蛋白，Bisulfite-PCR测序（BPS）检测m⁵C甲基化水平，体内裸鼠移植瘤模型评估肿瘤生长，以及生物信息学分析（CircBank、CircInteractome等数据库预测靶标）。

Characterization of circSMAD2 in PC

通过GEO数据库（GSE69362、GSE79634）分析发现circSMAD2在胰腺癌组织中高表达，经60对患者组织qRT-PCR、75对组织芯片原位杂交（ISH）验证，其高表达与患者T分期晚、预后差显著相关。细胞水平显示，circSMAD2在4种胰腺癌细胞系（PATU-8988、CFPAC-1等）中上调，通过Sanger测序、发散引物PCR、RNase R及放线菌素D（Actinomycin D）处理证实其为稳定环状RNA（783nt，源于SMAD2基因外显子2-6）。

circSMAD2 promotes PC cell proliferation in vitro and in vivo

沉默circSMAD2（si-circSMAD2）导致胰腺癌细胞G0/G1期阻滞，EdU、CCK-8及集落形成实验均显示细胞增殖受抑；体内裸鼠移植瘤模型中，sh-circSMAD2组肿瘤体积、重量显著降低，Ki-67表达下降，证实circSMAD2促进胰腺癌增殖。

circSMAD2 serves as a ceRNA by sequestering miR-769-5p

亚细胞分离与FISH显示circSMAD2定位于细胞质，RIP验证其与AGO2结合（ceRNA特征）。生物信息学筛选及qPCR发现circSMAD2沉默后miR-769-5p显著上调，临床样本中miR-769-5p与circSMAD2表达负相关。双荧光素酶报告基因证实circSMAD2直接结合miR-769-5p，且不影响其转录，明确其ceRNA功能。

The circSMAD2/miR-769-5p axis activates the AKT/mTOR pathway by modulating TRIM59

整合5个数据库预测miR-769-5p靶基因，结合TCGA及临床样本验证TRIM59为关键靶标（表达负相关）。双荧光素酶报告基因证实miR-769-5p结合TRIM59 3'-UTR，沉默circSMAD2降低TRIM59 mRNA及蛋白水平，且可被miR-769-5p抑制剂逆转；Western blot显示该过程伴随AKT/mTOR通路激活（p-AKT、p-mTOR上调），功能实验证实抑制miR-769-5p或TRIM59可阻断circSMAD2促增殖作用。

NSUN2 stabilizes circSMAD2 via m5C modification

RNA pulldown联合质谱发现NSUN2与circSMAD2结合，RIP及qPCR/Western blot验证两者直接互作。沉默NSUN2（si-NSUN2）显著降低circSMAD2表达，临床样本显示NSUN2与circSMAD2正相关；Actinomycin D处理及BPS测序证实NSUN2通过m⁵C修饰增强circSMAD2稳定性。

circSMAD2 interacted directly with IGF2BP1

RNA pulldown、RIP及FISH共定位验证circSMAD2与IGF2BP1细胞质互作，且两者mRNA水平无交叉调控。ARES预测IGF2BP1的KH3-KH4结构域为结合位点，突变实验（删除KH3/4域或circSMAD2外显子4的CATCAT基序）证实该互作依赖KH3-KH4结构域与CATCAT motif。

circSMAD2 serves as a scaffold to enhance the interaction between IGF2BP1 and TPT1 mRNA

RNA-seq结合starBase筛选发现TPT1为关键靶基因，IF/FISH显示三者共定位。BLAST比对发现circSMAD2的TAAAT motif与TPT1 3'-UTR AU富集区结合，双荧光素酶报告基因及突变实验验证该结合。RIP证实IGF2BP1结合TPT1 mRNA，沉默circSMAD2或突变其TAAAT motif可降低TPT1 mRNA稳定性；Western blot显示该过程激活AKT/mTOR通路，且IGF2BP1过表达的促增殖作用依赖circSMAD2与TPT1。

TPT1 is a functional target regulator of the circSMAD2/IGF2BP1 complex

过表达野生型circSMAD2（而非突变型）促进细胞增殖与体内成瘤，且该效应可被沉默TPT1阻断；IGF2BP1过表达的促增殖作用也依赖circSMAD2与TPT1，证实TPT1为复合物下游功能介质。

研究结论表明，circSMAD2是胰腺癌中首个被发现的m⁵C修饰致癌circRNA：一方面通过NSUN2介导的m⁵C修饰稳定自身，作为ceRNA吸附miR-769-5p，解除其对TRIM59的抑制，激活AKT/mTOR通路；另一方面作为分子支架，通过KH3-KH4结构域结合IGF2BP1，并通过CATCAT motif与TPT1 mRNA的TAAAT motif互作，增强IGF2BP1对TPT1 mRNA的稳定作用，进一步激活AKT/mTOR通路。双重机制协同驱动胰腺癌进展。

该研究具有重要科学意义：首次揭示m⁵C修饰对circRNA稳定性的调控作用，拓展了表观转录组学在环状RNA中的研究；阐明circSMAD2通过ceRNA与分子支架双重机制调控AKT/mTOR通路的创新模式，为胰腺癌分子机制研究提供新视角；circSMAD2在组织中的高稳定性与特异性表达，使其成为潜在的无创诊断标志物，而靶向其ceRNA活性或IGF2BP1结合界面的策略，有望为胰腺癌精准治疗提供新靶点。