《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Syringin disrupts the DLAT/MYC axis to dampen TAM polarization and suppress hepatocellular carcinoma progression
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针对肝癌（HCC）免疫治疗响应率低、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）M2型极化驱动免疫抑制微环境的难题，本研究筛选发现天然化合物丁香苷（syringin）。其通过结合二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）R430/N576位点，破坏DLAT/MYC蛋白乙酰化轴，促进MYC泛素化降解，显著抑制TAM M2极化及PD-L1表达。体内外实验证实其单药抑瘤且协同αPD-1增效，为HCC巨噬细胞导向治疗提供新策略。
肝癌（HCC）作为全球第六大常见癌症、第四大癌症致死原因，其高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）常导致酪氨酸激酶抑制剂、血管生成抑制剂及免疫检查点阻断剂（ICB）疗效不佳。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是TME中主要的免疫抑制细胞群，在肝癌进程中倾向于极化为促肿瘤的M2型，分泌IL-10、TGF-β等因子并高表达PD-L1，不仅直接促进肿瘤干细胞特性、上皮间质转化和血管生成，还抑制CD8+T细胞活性。尽管靶向CSF1/CSF1R或CCL2/CCR2等策略可调控TAM，但易误伤组织驻留巨噬细胞，限制临床应用。前期研究发现苯乙醇苷和苯丙素苷类化合物具有调节巨噬细胞极化的潜力，其中丁香苷（syringin）能增强一氧化氮（NO）释放，暗示其可能通过独特机制干预M2极化。然而，丁香苷是否及如何特异性靶向巨噬细胞代谢重编程以抑制肝癌进展，其直接分子靶点与下游信号轴仍不明确。为此，广州大学的研究团队开展了系统研究，发现丁香苷通过靶向DLAT/MYC轴抑制TAM M2极化，显著增强PD-1阻断疗效，相关成果发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》。
研究主要采用以下关键技术：利用骨髓来源巨噬细胞（BMDM）和THP-1细胞构建M2极化模型筛选化合物；通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析丁香苷对肝癌TME的重塑作用；采用基于亲和性的蛋白质谱分析（ABPP）结合点击化学探针（syringin-p）鉴定直接靶点；利用生物膜层干涉技术（BLI）、细胞热转移 assay（CETSA）验证小分子-蛋白互作；通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除、点突变及回补实验阐明DLAT结合位点与MYC调控机制；构建原位肝癌模型、SB转座子诱导肝癌模型及患者来源异种移植（PDX）模型评估体内疗效及与αPD-1的协同作用；借助染色质免疫共沉淀（ChIP）-qPCR揭示MYC对PD-L1转录的调控。
3.1. 苯丙素苷丁香苷抑制巨噬细胞M2极化并阻碍肝癌进展
通过对49种苯乙醇苷/苯丙素苷的筛选，发现丁香苷在IL-4刺激的BMDM中表现出最强的抑制Arg1表达和IL-10释放的能力。剂量依赖性实验证实其显著降低M2标志物（Arg1、Ym1、CD206）mRNA及蛋白水平，且在THP-1来源巨噬细胞中效果一致。体内实验中，丁香苷在Hepa1-6原位模型和皮下模型中均显著抑制肿瘤生长，且在裸鼠中仍有效，提示其作用不依赖T细胞毒性，而是通过调控巨噬细胞实现。器官H&E染色显示无明显毒性。
3.2. 丁香苷通过阻断TAM极化重塑TME抑制肝癌进展
scRNA-seq分析显示，丁香苷处理后肿瘤中M2样巨噬细胞比例降低，M1样比例升高，巨噬细胞亚群中Mrc1、Il10、Ym1表达下调。流式细胞术和多重免疫荧光进一步验证了F4/80+CD206+（M2）减少、F4/80+CD86+（M1）增加。联合CSF1R抗体耗竭巨噬细胞后，丁香苷抑瘤作用消失，证明疗效依赖于巨噬细胞。GSEA分析提示MYC靶点和氧化磷酸化（OXPHOS）通路被显著抑制。
3.3. 丁香苷通过MYC调控巨噬细胞M2极化
丁香苷处理降低IL-4诱导的MYC蛋白水平，但不影响Myc mRNA，且下调MYC下游基因（Dusp2、Pa2g4等）。过表达MYC可逆转丁香苷对M2标志物的抑制，而Myc敲低则模拟该效应，回补shRNA抗性rMYC可恢复。在髓系特异性Myc敲除（Lyz2+Mycf/f）小鼠中，丁香苷无法进一步抑制M2极化及肿瘤生长，明确了MYC的必要性。
3.4. 丁香苷直接结合DLAT
CHX追踪实验显示丁香苷加速MYC蛋白降解，MG132处理可阻断此效应，且增加MYC泛素化。CETSA表明丁香苷不影响MYC热稳定性，提示间接作用。通过合成叠氮修饰探针（syringin-p）的竞争性ABPP，结合质谱鉴定出DLAT为直接靶点。BLI和CETSA证实丁香苷与重组DLAT及细胞内DLAT直接结合。
3.5. 丁香苷通过DLAT抑制MYC乙酰化并促进其降解
Co-IP证实DLAT与MYC在巨噬细胞中相互作用。体外乙酰化实验显示丁香苷抑制DLAT介导的MYC乙酰化，且干扰DLAT与乙酰辅酶A结合。分子对接预测丁香苷通过氢键（R430、N576）和疏水作用结合DLAT，点突变（R430A、N576K）显著降低结合亲和力。在DLAT敲除iBMDM中回补双突变体（R430A+N576K）后，丁香苷无法调控MYC乙酰化、泛素化及CD206表达，证明R430和N576是关键结合位点。
3.6. 丁香苷增强PD-1/PD-L1阻断在肝癌中的治疗效果
丁香苷降低TAM及肿瘤细胞表面PD-L1表达，且MYC敲低显著下调Cd274（编码PD-L1）mRNA。ChIP-qPCR证实MYC直接结合Cd274启动子，丁香苷抑制此结合。体内联合αPD-1治疗显示，在原位模型、SB诱导模型及PDX模型中均显著协同抑制肿瘤生长、延长生存期，并增加IFN-γ+CD8+T细胞比例。
本研究首次阐明天然苯丙素苷丁香苷通过靶向代谢酶DLAT调控MYC稳定性，进而抑制TAM M2极化和PD-L1表达的分子机制。关键发现包括：1）丁香苷不直接杀伤肿瘤细胞，而是通过巨噬细胞-centric途径发挥作用，在巨噬细胞耗竭或髓系Myc敲除小鼠中失效；2）DLAT被鉴定为丁香苷的直接靶点，其R430和N576残基是结合关键位点，丁香苷通过占据此位点破坏DLAT对MYC K148位的乙酰化，促进MYC泛素化降解；3）MYC不仅是M2极化的核心转录驱动因子（调控Arg1、Il10、Mrc1等），还通过直接结合Cd274启动子上调PD-L1，丁香苷通过抑制MYC显著削弱此效应；4）体内外多模型验证丁香苷单药抑瘤，并与αPD-1产生协同增效，尤其在PDX模型中显示出临床转化潜力。
该研究的重要意义在于：从传统药用植物来源的天然产物中挖掘出具有明确巨噬细胞靶向活性的先导化合物，通过ABPP等化学生物学手段精准鉴定DLAT为新靶点，揭示了“丁香苷-DLAT-MYC-PD-L1”这一连接代谢重编程与免疫逃逸的信号轴，为克服HCC免疫治疗耐药提供了“调节TAM极化+增强ICB响应”的双效策略。同时，研究明确了MYC在巨噬细胞代谢-免疫串扰中的枢纽地位，为开发基于巨噬细胞代谢干预的肿瘤免疫治疗提供了新视角。
