《Acta Pharmaceutica Sinica B》：NFYB–lncRNA axis resets the tumor microenvironment to promote HCC aggressive progression by a positive feedback loop
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本研究针对肝细胞癌(HCC)转移与免疫抑制微环境相互作用的机制展开探索。研究人员通过ATAC-seq（转座酶可及性染色质测序）与功能实验揭示了NFYB–LINC01137信号轴如何通过稳定NFYB蛋白、招募SMYD3上调IL-1β、CXCL2和CCL20的表达，从而驱动肿瘤相关巨噬细胞(TAM)向M2表型极化，形成抑制性肿瘤免疫微环境(TIME)并诱导PD-L1耐受。研究证实，联合使用IL-1β抑制剂可增强PD-L1阻断在NFYB高表达HCC中的疗效，为肝癌的免疫联合治疗提供了新策略。
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是全球范围内最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其死亡率在癌症相关死亡原因中高居第三。尽管近年来HCC的诊断和治疗取得了一定进展，但转移仍然是导致患者死亡的主要原因。一个令人困惑的临床现象是，许多患者在确诊时就已发生转移，这表明肝癌细胞可能天生就具备了“远走高飞”的能力。那么，是什么内在的分子机制赋予了肝癌细胞如此强大的转移潜能？更重要的是，肿瘤细胞是如何“驯化”其周围的免疫细胞，为自己创造一个免疫抑制的“舒适区”，从而逃避免疫系统攻击并促进转移的呢？这些问题一直是肝癌研究领域的难点和热点。
针对上述问题，Boxuan Zhou, Qiang Tao, Wu Wen, Jianan Tan, Jie Xu, Yixuan Fang, Jiao Guan, Xiaorong Lin, Jiehua He, Milad Ashrafizadeh, Zifeng Wang, Jo?o Conde, Fang Zheng等研究人员在《Acta Pharmaceutica Sinica B》上发表了一项研究，为我们揭示了一个名为“NFYB–lncRNA轴”的关键信号通路。该通路像一个精密的“主控开关”，不仅直接驱动肝癌细胞的恶性行为，还能“远程遥控”肿瘤微环境，将其重塑为一个有利于肿瘤生长和转移的免疫抑制状态。
为了深入探究HCC转移背后的机制，研究人员运用了多种前沿技术。他们从两位患者的原发肿瘤和对应的肺转移灶中分离出癌细胞进行研究。关键技术方法包括：利用ATAC-seq（转座酶可及性染色质测序）在全基因组范围内比较原发灶和转移灶的染色质可及性（chromatin accessibility）图谱；通过RNA免疫共沉淀（RIP）、RNA下拉（pull-down）、染色质免疫共沉淀（ChIP）等实验验证蛋白质与RNA、蛋白质与DNA的相互作用；构建稳定的基因敲除和过表达细胞系，并结合小鼠原位肝癌模型和肺转移模型进行体内功能验证；使用流式细胞术、免疫荧光、多重免疫荧光等技术分析肿瘤微环境中的免疫细胞浸润情况。
3.1. 原发性和转移性HCC中存在两种不同的染色质可及性景观
通过ATAC-seq分析发现，与原发肿瘤相比，转移性HCC中有大量远端调控区域的染色质变得更为开放。这些动态可及区域与免疫系统和细胞因子/趋化因子的产生相关。转录因子足迹分析进一步揭示，核转录因子Y（NF-Y）家族，尤其是其亚基NFYB，在转移灶中的结合活性显著增强。
3.2. NFYB是与免疫抑制和HCC患者不良预后相关的关键基因
生信分析和实验验证表明，NFYB在转移性HCC组织和细胞系中表达显著上调。高表达NFYB与更具侵袭性的肿瘤表型、肿瘤微环境中CD45+免疫细胞减少以及患者更短的疾病无复发生存期显著相关。
3.3. NFYB促进HCC进展并诱导抑制性TIME
在细胞实验中，过表达NFYB增强了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而敲低NFYB则抑制了这些恶性表型。在小鼠模型中，过表达NFYB的肝癌细胞形成了更大的原位肿瘤和更多的肺转移灶。更重要的是，这些肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）显著增多，而CD8+和CD4+T细胞则明显减少，表明NFYB诱导了一个免疫抑制的肿瘤微环境。
3.4. HCC来源的NFYB诱导巨噬细胞的募集和M2样极化
研究人员发现，与NFYB高表达的HCC细胞共培养后，巨噬细胞会表达更高水平的M2型标志物（如CD163, CD206, IL-10），表现出更强的趋化迁移能力，并且其抑制T细胞增殖和活化的功能也增强了。这表明NFYB过表达的HCC细胞能够“招募”并“教化”巨噬细胞，使其转变为具有免疫抑制功能的M2表型。
3.5. 删除TAMs可抑制NFYB诱导的HCC转移
为了证实TAMs在此过程中的关键作用，研究人员使用了缺乏巨噬细胞的Csf1op/op小鼠。结果显示，在这些小鼠中，NFYB过表达所诱导的肿瘤生长和肺转移被显著抑制，同时肿瘤内CD8+T细胞的比例得以恢复。这直接证明了TAMs是NFYB促转移效应中不可或缺的“帮凶”。
3.6. LINC01137通过抑制NFYB降解来促进巨噬细胞极化和募集
为了寻找调控NFYB的上游分子，研究人员通过RNA下拉和质谱分析，发现了一个名为LINC01137的长链非编码RNA（lncRNA）。实验证实LINC01137能够与NFYB蛋白直接结合。其机制在于，LINC01137通过抑制NFYB蛋白第109和111位赖氨酸（K109/111）的泛素化，从而阻止其被蛋白酶体降解，稳定了NFYB蛋白水平。当敲低LINC01137时，NFYB介导的巨噬细胞M2极化和募集效应被显著削弱。
3.7. LINC01137与SMYD3和KAT2B的关联
研究人员进一步发现LINC01137还能与组蛋白甲基转移酶SMYD3和组蛋白乙酰转移酶KAT2B相互作用。这提示LINC01137可能作为一个“分子支架”，将不同的表观遗传调控因子聚集在一起。
3.8. HCC中NF-Y的表达调控LINC01137转录
有趣的是，研究发现了双向调控的存在。当敲低NFYB时，LINC01137的表达也下降了。通过荧光素酶报告基因和ChIP实验，研究人员证实NFYB能够直接结合到LINC01137基因的启动子区域，激活其转录。这表明两者之间形成了一个前馈循环（feed-forward loop）：NFYB促进LINC01137转录，而LINC01137又反过来稳定NFYB蛋白。
3.9. NFYB对于招募KAT2B到LINC01137启动子是必需的
实验证明，NFYB能与KAT2B形成复合物，并招募其到LINC01137的启动子区域。KAT2B催化组蛋白H3第9位赖氨酸发生乙酰化（H3K9ac），这是一种与基因激活相关的表观遗传标记，从而进一步促进LINC01137的转录。敲低NFYB会破坏KAT2B的招募并降低H3K9ac水平。
3.10. LINC01137通过促进SMYD3/NF-Y复合物的形成，经由调控活性标记H3K4me3诱导IL-1β、CXCL2和CCL20的表达
RNA-seq分析显示，敲低LINC01137会下调一系列细胞因子和趋化因子，其中IL-1β、CXCL2和CCL20的下调最为显著。机制研究表明，LINC01137通过增强NFYB与SMYD3的相互作用，将SMYD3招募到IL-1β、CXCL2和CCL20的启动子区域。SMYD3催化产生组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化（H3K4me3），这是一种强烈的基因激活信号，从而上调这三个关键因子的表达。
3.11. 鉴定出的NFYB/LINC01137/IL-1β/CXCL2/CCL20轴诱导抑制性TIME
功能回复实验证实，在敲低LINC01137的细胞中加入IL-1β、CXCL2或CCL20的重组蛋白，可以恢复巨噬细胞的M2极化。在体内小鼠模型中，使用IL-1β抑制剂（Diacerein）或敲低CXCL2/CCL20，能够显著抑制由LINC01137过表达所驱动的肿瘤肺转移，并逆转肿瘤微环境中的免疫抑制状态（减少TAMs，增加CD8+T细胞）。临床样本分析也显示，NFYB、LINC01137、IL-1β、CXCL2和CCL20的表达水平在HCC组织中呈正相关，且与免疫抑制微环境相关。
3.12. 抗PD-L1与IL-1β抑制剂Dia联用显著抑制NFYB诱导的HCC转移
研究发现，NFYB/LINC01137轴激活的微环境也上调了巨噬细胞上的PD-L1表达。在NFYB过表达的小鼠肝癌模型中，单独使用抗PD-L1抗体或IL-1β抑制剂Diacerein仅能部分抑制肿瘤生长和转移。然而，两者联合治疗产生了显著的协同抗肿瘤效果，能最有效地抑制肿瘤进展和肺转移，并显著改善肿瘤微环境（增加细胞毒性T细胞，减少TAMs和髓源性抑制细胞MDSCs）。
本研究系统地揭示了一个驱动HCC侵袭性进展的核心机制：NFYB–LINC01137信号轴。该轴通过一个精巧的正反馈环路实现自我放大和持续激活。一方面，NFYB与KAT2B结合，通过乙酰化LINC01137启动子区域的组蛋白来激活其转录；另一方面，LINC01137通过抑制泛素化降解来稳定NFYB蛋白。稳定的NFYB进而招募组蛋白甲基转移酶SMYD3，在促炎因子IL-1β、CXCL2和CCL20的启动子区域沉积H3K4me3激活标记，从而大幅上调这些因子的表达。
高表达的IL-1β、CXCL2和CCL20构成了一个“化学引诱物和活化剂”网络，它们将巨噬细胞大量募集到肿瘤部位，并将其极化为具有免疫抑制功能的M2表型。这些被“驯化”的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）不仅直接抑制了杀伤性T细胞的功能，还进一步上调了免疫检查点蛋白PD-L1的表达，导致免疫治疗耐受。这最终塑造了一个极度有利于肿瘤生长、转移和免疫逃逸的抑制性肿瘤免疫微环境（TIME）。
该研究最重要的临床意义在于其转化价值。它不仅在机制上解释了为何部分HCC患者对单一的PD-1/PD-L1抑制剂治疗不敏感，更重要的是，提出了一个行之有效的联合治疗策略。实验证明，使用IL-1β抑制剂Diacerein可以“解除”由NFYB–LINC01137轴建立的免疫抑制，使“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”，从而显著增强PD-L1阻断疗法的疗效。这为NFYB高表达的肝癌患者，特别是那些对现有免疫治疗应答不佳的患者，提供了一个极具前景的个性化治疗新方向。研究最终表明，靶向肿瘤微环境的“土壤”与靶向免疫检查点的“种子”相结合，有望成为攻克肝癌治疗瓶颈的一把新钥匙。
