《Leukemia》：Synergizing hypomethylating agents with off-the-shelf CD70-targeted chimeric antigen receptor-engineered natural killer T cells for the treatment of acute myeloid leukemia
编辑推荐：
本期推荐：急性髓系白血病（AML）的治疗仍面临复发和耐药挑战。低甲基化药物（HMAs）可上调肿瘤细胞表面CD70、CD1d及NK受体配体表达。本研究据此开发了两种CD70靶向的嵌合抗原受体-NKT细胞，发现它们与HMAs协同可增强抗AML活性，其中脐血造血干细胞/祖细胞来源的AlloCAR70-NKT细胞显示出更优的抗肿瘤效果、多靶点识别能力及安全性，为开发“即用型”细胞疗法提供了新策略。
急性髓系白血病（AML）是一种侵袭性强的血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓中未分化的髓系前体细胞不受控制地扩增。尽管治疗手段有所进步，但老年患者的总生存期仍然令人沮丧。低甲基化药物（HMAs），如阿扎胞苷和地西他滨，代表了一种低强度的治疗选择，它们可以逆转异常的DNA甲基化，并重新编程白血病细胞向分化和免疫识别方向转变。然而，其临床疗效仍受限于不完全缓解率和复发，这突显了对能够增强抗白血病免疫力同时保持耐受性的联合策略的需求。近年来，嵌合抗原受体（CAR）工程化T细胞疗法在血液肿瘤治疗中展现出巨大潜力，但传统的CAR-T细胞疗法存在引发移植物抗宿主病（GvHD）、细胞因子释放综合征（CRS）等风险，且多为患者自体来源，难以实现“即用型”（off-the-shelf）应用。那么，能否找到一种兼具高效抗肿瘤活性和高安全性的新型“即用型”免疫细胞疗法，并与现有药物（如HMAs）协同，为AML患者带来新的希望呢？
为此，研究人员在《Leukemia》杂志上发表了他们的最新研究成果。他们开发了靶向CD70的CAR工程化不变自然杀伤T（CAR-NKT）细胞，并探索其与HMAs联合治疗AML的协同效应。研究发现，HMAs能上调AML细胞表面的CD70、CD1d（NKT细胞TCR的识别配体）以及自然杀伤受体（NKR）配体，从而使肿瘤细胞更容易被CAR-NKT细胞识别和杀伤。基于此，研究团队生成了两种CD70靶向的CAR-NKT细胞：一种是脐带血造血干细胞/祖细胞（HSPC）来源的异体CAR70-NKT（AlloCAR70-NKT）细胞，另一种是外周血单个核细胞（PBMC）来源的CAR70-NKT（PBMCCAR70-NKT）细胞。在多种AML异种移植小鼠模型中，AlloCAR70-NKT细胞与HMAs（如地西他滨）联用，能有效清除AML肿瘤，且不诱导GvHD、CRS或长期器官毒性。这些发现表明，AlloCAR70-NKT细胞是一种安全、强效的“即用型”免疫疗法，可与HMAs协同改善AML患者的治疗结局。
为开展此项研究，作者运用了几个关键技术方法：首先是细胞工程与制备，利用慢病毒载体系统构建了共表达人不变NKT细胞TCR、CD70特异性CAR和可溶性IL-15的基因盒，并分别转导至人脐带血来源的CD34+HSPC和健康供者PBMC来源的NKT细胞，通过多阶段、无饲养细胞的定向分化培养体系（对于HSPC）或临床适应的扩增流程（对于PBMC）生成CAR70-NKT细胞。其次是体内外功能与机制验证，包括使用流式细胞术分析抗原表达，体外细胞毒性实验评估杀伤效率，以及利用NSG小鼠构建THP1、HL60、KG1等多种人AML细胞系的异种移植模型，进行体内抗肿瘤疗效、生物分布、持久性和安全性（GvHD、CRS、长期毒性）评价。研究中使用的细胞系和原代细胞（如HSPC、PBMC）均有明确的商业或机构来源。
HMAs upregulate CD70, CD1d, and NKR ligands on AML blasts
研究人员首先证实，长期低剂量的HMA（地西他滨或阿扎胞苷）处理，能在体外和体内（小鼠模型）上调三种代表性AML细胞系（THP1、KG1、HL60）表面CD70、CD1d以及多种NKR配体（如MICA/B、ULBPs、CD112/CD155）的表达。值得注意的是，原本CD70表达极低的HL60细胞，经HMA处理后CD70表达显著诱导。从荷瘤小鼠骨髓中分离的AML细胞也表现出相同的抗原上调模式。这表明HMA治疗不仅能直接抑制AML进展，还能通过重塑肿瘤抗原格局增强其免疫原性，为联合CAR-NKT细胞治疗提供了机制基础。
Generate human HSPC and PBMC-derived CAR70-NKT cells
接下来，研究团队成功制备了两种CAR70-NKT细胞。AlloCAR70-NKT细胞通过一个为期6周的、临床导向的5阶段无饲养细胞分化方案从基因工程化的脐带血HSPC中产生，最终产品纯度超过97%，且CAR表达均一（>99%）。PBMCCAR70-NKT细胞则通过对健康供者PBMC中的NKT细胞进行分选、激活、慢病毒转导和扩增获得，纯度也超过97%，但CAR转导率（通过GFP共表达评估）约为50-60%。在可扩展性方面，单个脐带血单位可产生超过1012个AlloCAR70-NKT细胞，足以制备成千上万个治疗剂量，展现出巨大的“即用型”生产潜力。
Characterize human HSPC and PBMC-derived CAR70-NKT cells
对两种CAR70-NKT细胞的表型与功能进行比对发现，AlloCAR70-NKT细胞不表达CD70，而PBMCCAR70-NKT细胞高表达CD70。CD70的缺失使得AlloCAR70-NKT细胞避免了因表达自身靶点而可能发生的“自相残杀”（fratricide），在扩增能力和耗竭标志物表达上均优于PBMCCAR70-NKT细胞。此外，AlloCAR70-NKT细胞以CD8+和双阴性（DN）亚群为主，分泌更高水平的Th1型细胞因子（如IFN-γ、TNF-α），表达更高水平的NK相关标志物（如CD56、NKG2D、DNAM-1）和细胞毒性分子（穿孔素、颗粒酶B），呈现出更具细胞毒性、更少耗竭的表型。
AlloCAR70-NKT cells exhibit potent antitumor activity against AML in vitro and synergize with HMAs
体外杀伤实验表明，两种CAR70-NKT细胞均能有效杀死CD70+的AML细胞。其中，AlloCAR70-NKT细胞还能通过其NKR（NKG2D、DNAM-1等）识别并杀伤CD70-CD1d-的AML细胞，展现了CAR、TCR/CD1d、NKR介导的三重靶向能力，而PBMCCAR70-NKT细胞则缺乏显著的NKR介导的杀伤。预先用HMA处理AML细胞，可显著增强两种CAR70-NKT细胞对其的杀伤作用，并提升AlloCAR70-NKT细胞的IFN-γ和颗粒酶B产生。相比之下，化疗药物氟达拉滨预处理则无此增效作用，说明增效源于HMA特异的抗原上调。
AlloCAR70-NKT cells display robust in vivo antileukemic efficacy across multiple AML models and synergize with HMAs
在体内疗效实验中，研究人员构建了CD70高表达的THP1和CD70低表达的HL60两种AML异种移植小鼠模型。对于THP1模型，单用地西他滨可部分控制肿瘤，但联合AlloCAR70-NKT细胞治疗后实现了肿瘤的完全清除和动物的长期存活。对于CD70低表达的HL60模型，单用AlloCAR70-NKT细胞疗效有限，但与地西他滨联用后，肿瘤控制、小鼠生存期以及治疗细胞在肝脏、肺等器官的扩增均得到显著增强。在另一个CD70低表达的KG1模型中也观察到了类似的协同效应。这些结果证明，HMA预处理对于有效靶向CD70低表达的AML至关重要，二者联用可产生强大的协同抗白血病效果。
AlloCAR70-NKT cells demonstrate a favorable safety profile in vivo
安全性评估是临床转化的关键。在GvHD模型中，输注常规的CAR70-T细胞会迅速诱发严重的异种GvHD，导致小鼠体重下降、高临床评分和早期死亡。而输注AlloCAR70-NKT或PBMCCAR70-NKT细胞的小鼠则未出现GvHD迹象。在CRS模型中，常规CAR70-T细胞引发了显著的体重下降及血清中小鼠IL-6和SAA-3水平升高，而两种CAR70-NKT细胞则未诱导这些CRS相关变化。值得注意的是，AlloCAR70-NKT细胞虽产生高水平的Th1细胞因子，但不产生人IL-6。长期毒性实验显示，即使高剂量输注AlloCAR70-NKT细胞，120天后也未在主要器官中检测到组织病理学异常。
研究结论与意义
本研究的核心结论是：低甲基化药物（HMAs）能上调AML细胞表面的CD70、CD1d和NKR配体，从而“武装”肿瘤，使其对CD70靶向的CAR-NKT细胞治疗更为敏感。研究人员成功开发了两种“即用型”CAR70-NKT细胞疗法，其中源自脐带血HSPC的AlloCAR70-NKT细胞在多个层面表现更优：具有均一的CAR表达、天然缺乏CD70从而避免自相残杀、拥有CAR/TCR/NKR三重靶向机制、呈现Th1优势且高细胞毒性的表型、具备极强的可扩展性，并且在临床前模型中显示出卓越的抗肿瘤活性和极高的安全性（无GvHD、低CRS风险、无长期毒性）。
这项研究的意义重大。首先，它提出了一种极具前景的AML联合治疗新策略，将表观遗传药物（HMAs）与新型细胞免疫疗法（CAR-NKT）相结合，通过药物诱导肿瘤抗原增强，进而放大免疫细胞的识别与杀伤，有望克服AML的异质性和耐药性。其次，研究验证了AlloCAR70-NKT细胞作为“即用型”疗法的巨大潜力，其“现货供应”、无需个体化制备的特性，可大幅降低成本、缩短等待时间，使更多患者受益。最后，该研究系统地展示了CAR-NKT细胞，特别是HSPC来源的工程化产品，在安全性上的显著优势，为将这类新型免疫细胞疗法推向AML乃至其他CD70阳性恶性肿瘤的临床试验奠定了坚实的临床前基础。
