《Virology》：Development of an S protein-based indirect ELISA for detecting IgA antibodies against porcine deltacoronavirus
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本研究通过单克隆CHO细胞系表达猪德尔塔冠状病毒S蛋白，建立间接酶联免疫吸附试验（iELISA）检测血清和乳汁中IgA抗体。结果显示iELISA特异性高，无交叉反应，灵敏度达1:4500，重复性良好，与间接免疫荧光试验符合率分别达95.68%和93.02%，为PDCoV感染监测和疫苗评估提供可靠工具。
赵志明|余瑞明|戴静雅|周鹏|张丽萍|白英杰|王东升|潘莉|郭慧琴|刘霞|刘新生|张忠旺
中国农业科学院兰州兽医研究所兰州大学兽医学院动物疾病控制与预防国家重点实验室，中国兰州，730046
摘要
猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是一种新兴的冠状病毒，主要感染仔猪，引起以水样腹泻、呕吐、脱水和生长迟缓为特征的急性肠道疾病。由于PDCoV通过粪-口途径传播，并主要针对黏膜免疫系统，免疫球蛋白A（IgA）已被确定为感染检测和疫苗评估的关键生物标志物。在PDCoV感染过程中，病毒刺突（S）蛋白介导受体结合和膜融合，同时也是诱导抗体反应的主要因子，使其成为检测PDCoV抗体的理想抗原。在本研究中，PDCoV S蛋白在单克隆中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中表达，并用作涂层抗原，建立了一种间接酶联免疫吸附测定（iELISA）方法来检测PDCoV特异性IgA。该检测方法未与阳性猪流行性腹泻病毒（PEDV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪轮状病毒（PoRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）样本发生交叉反应，表明其具有高特异性。该方法还成功检测到阳性血清（稀释度1:4500）和乳汁样本（稀释度1:4000），检测内的和检测间的变异系数均低于10%，显示出高灵敏度和重复性。与间接免疫荧光测定（IFA）相比，iELISA在血清和乳汁样本上的符合率分别为95.68%和93.02%。因此，我们的iELISA是一种特异性强、灵敏度高的可靠工具，适用于血清和乳汁中PDCoV IgA抗体的检测，可用于感染监测和疫苗评估。
引言
猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）属于冠状病毒科（Coronaviridae）中的德尔塔冠状病毒属（Deltacoronavirus），是一种新兴的肠道致病病毒，可导致仔猪出现腹泻和呕吐（Jung等人，2015年）。PDCoV于2012年首次在香港的分子监测研究中被发现，2014年在美国的暴发事件后其致病潜力得到证实（Chen等人，2015年；Li等人，2014年；Ma等人，2015年）。自其临床出现以来，该病毒迅速传播到主要养猪国家，包括中国大陆（Wang等人，2015年）、韩国（Lee & Lee，2014年）和加拿大（Ajayi等人，2018年）。因此，广泛的PDCoV暴发给全球养猪业造成了重大经济损失（Song等人，2015年；Zhai等人，2016年）。
PDCoV是一种有包膜的单链正链RNA病毒，基因组大小约为25.4 kb（Jin等人，2021年），使其成为已知最小的冠状病毒之一（Zhang等人，2022年）。与其他冠状病毒类似，PDCoV基因组包含一个开放阅读框1a/1b（ORF1a/1b），编码四种结构蛋白：刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核衣壳（N）（Wang等人，2022年）。从结构上看，S蛋白由S1和S2亚单位组成，对病毒感染至关重要（Chen等人，2020年）。具体而言，S蛋白通过结合宿主细胞受体并促进膜融合来介导病毒进入，并在宿主体内诱导中和抗体（Zhang等人，2019年；Du等人，2024年）。因此，S蛋白可作为早期诊断PDCoV的主要靶抗原。
IgA是黏膜分泌物（如乳汁、唾液和眼泪）中的主要免疫球蛋白，在循环中的含量仅次于IgG（Gesualdo等人，2021年）。黏膜免疫系统是抵御PDCoV的第一道防线，IgA通过结合病毒颗粒阻止细胞入侵，在上皮细胞中中和病毒，抑制感染和复制（Huang等人，2023年）。PDCoV感染后，IgA在黏膜表面比IgG更早产生，这缩短了检测窗口期，有助于及时干预、限制传播并降低成本。因此，监测血清和乳汁样本中的IgA抗体水平可用于评估猪的PDCoV感染状态。
多种检测方法——包括基于核酸的方法（聚合酶链反应、逆转录-PCR、环介导等温扩增和下一代测序）（Ren等人，2024年；Lu等人，2023年）、免疫学检测（间接免疫荧光测定、Western blotting和病毒中和试验）（Zhao等人，2020年）以及新兴的分子平台如CRISPR-Cas——都是重要的病毒鉴定和表征工具（Luo等人，2024年）。相比之下，检测病毒特异性抗体或抗原的血清学方法因其简单性和适用于高通量检测而具有优势。其中，酶联免疫吸附测定（ELISA）由于其高灵敏度、特异性和适应性而被广泛使用（Aydin等人，2025年）。近年来，各种ELISA方法已被广泛用于检测多种猪病，如猪流行性腹泻病毒（PEDV）（Shan等人，2019年）、猪轮状病毒（PoRV）（Zhu等人，2013年）和PDCoV（Bai等人，2025年）。基于PDCoV重组结构蛋白，还开发了几种间接ELISA（iELISA）方法，包括N蛋白（Thachil等人，2015年）、S1蛋白（Lu等人，2020年）和M蛋白（Luo等人，2017年）。为了使检测方法适用于大规模商业应用，必须保持稳定的可重复性能。需要统一可靠的抗原来源以确保结果的一致性。然而，在许多检测方法中，抗原蛋白是通过瞬时转染产生的，这常常导致批次间差异较大。因此，克服这些限制可以显著提高检测性能，确保结果的准确性和可靠性。
在本研究中，PDCoV S蛋白在单克隆中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中表达，确保了抗原来源的一致性和均匀性。基于这种S蛋白表达，开发了一种iELISA方法来检测血清和乳汁样本中的PDCoV特异性IgA抗体。该检测方法表现出良好的性能，包括高灵敏度、强特异性和良好的重复性。总体而言，我们的iELISA为监测PDCoV特异性免疫反应提供了可靠有效的工具，支持流行病学调查和诊断应用。
病毒、试剂和细胞
PDCoV株CH/XJYN/2016（GeneBank登录号MN064712）以及阳性PDCoV、PEDV、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪轮状病毒（PoRV）、口蹄疫病毒（FMDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）血清样本均来自中国农业科学院兰州兽医研究所动物疾病控制与预防国家重点实验室。猪肾上皮细胞（LLC-PK1）保存在我们的实验室中
PDCoV S蛋白的表达、纯化和鉴定
通过Western blotting验证了在单克隆CHO细胞系中稳定表达的PDCoV S蛋白。一个明显的His标签特异性条带证实了成功的表达，而在PDCoV阳性血清中检测到了强烈的信号，表明了强烈的抗原反应性（图1A）。
为了进一步获得高质量的iELISA开发用抗原，使用Ni亲和层析法纯化了重组S蛋白。SDS-PAGE结合Coomassie brilliant blue染色显示了一个明显的条带
讨论
PDCoV的全球传播凸显了迫切需要可靠的诊断方法来监测感染并指导控制措施。因此，我们开发了一种基于单克隆CHO细胞系产生的重组S蛋白（涂层抗原）的iELISA方法，用于检测血清和乳汁样本中的PDCoV特异性IgA。我们的iELISA与IFA结果一致，表现出优异的性能，包括高灵敏度、强重复性，并且与其他猪病原体无交叉反应。
CRediT作者贡献声明
张忠旺：撰写——审稿与编辑、验证、监督、方法学、资金获取、数据管理。赵志明：撰写——审稿与编辑、验证、数据管理。余瑞明：方法学、数据管理。刘霞：验证、监督。刘新生：验证、监督、方法学、资金获取。张丽萍：监督。白英杰：验证、研究。戴静雅：研究。周鹏：方法学。郭慧琴：验证、监督。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
数据可用性声明
支持本研究结果的实验数据可向第一作者或通讯作者索取。
资助
本研究得到了甘肃省重大科技项目（项目编号：23ZDNA007）、国家生猪技术创新中心（NCTIP-XD/C 03）和中国农业研究系统（项目编号：CARS-35）的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
