《Cancer and Metastasis Reviews》：Measurable residual disease testing in acute myeloid leukemia: current state, foundational models, and tools for future development
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这篇综述系统梳理了急性髓系白血病（AML）可测量残留病（MRD）检测的最新进展与挑战。文章深入探讨了当前检测平台（如流式细胞术、qPCR、NGS）的技术原理、优势局限与标准化难题，并强调了在克隆性造血（CHIP）背景下区分良性克隆与恶性残留的复杂性。最后，展望了单细胞测序、多模态整合等新兴工具在提升MRD检测灵敏度、特异性及临床转化应用方面的广阔前景。
当前AML管理范式与MRD的意义
急性髓系白血病（AML）是一种异质性强、致死率高的血液恶性肿瘤，尽管过去十年取得了显著进展，其预估5年总生存率仍仅为32%。患者通常表现为中性粒细胞减少导致的反复感染、高白细胞血症引起的白细胞淤滞、贫血导致的乏力气短，以及血小板减少引发的出血或瘀伤。诊断依赖于外周血和骨髓标本的流式细胞术免疫表型分析和免疫组化，并辅以二代测序（NGS）、细胞遗传学和荧光原位杂交（FISH）等分子研究。现代诊断已不再仅依据20%原始细胞的旧有阈值，而是结合分子亚型采用不同定义标准。
初始诱导治疗通常包括强化化疗（阿糖胞苷联合蒽环类药物）或强度较低的疗法（如去甲基化药物联合BCL-2抑制剂维奈克拉）。尽管50-70%的患者经强化治疗可达形态学完全缓解（CR），但其中高达80%的患者最终会复发，复发后中位总生存期不足6个月。在此背景下，可测量残留病（MRD）的监测，即治疗后残存的、低于常规病理检测阈值的微量疾病，已成为改善患者分层、细化预后和指导治疗的关键领域。在急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤中，MRD阴性已是改善生存的重要预测指标，其应用正在深刻改变治疗格局。
AML中MRD靶点选择的生物学基础
MRD检测的生物学基础复杂，首先需理解用于研究的体内数据来源。骨髓和外周血均可用于疾病监测，但两者的生物学等效性仍是研究热点。骨髓取样是金标准，但具有侵入性；外周血检测创伤小，便于纵向监测，但灵敏度较低。目前成人AML诊断和监测通常采用单部位骨髓穿刺，这基于“一个部位的结果代表整个造血区室”的假设，然而新证据表明AML克隆存在空间异质性。
现代AML诊断基于世界卫生组织（WHO）分类和国际共识分类（ICC）两大框架，它们结合形态学、细胞遗传学和分子数据来定义疾病实体和风险类别。这两个体系均认识到两种白血病前期状态——意义未明的克隆性造血（CHIP）和意义未明的克隆性血细胞减少症（CCUS），这对MRD解读尤为重要。CHIP/CCUS可先于或与AML共存，其进展为显性恶性肿瘤的风险因变异等位基因频率（VAF）、突变类型和数量等因素而异。例如，对于VAF>20%的剪接因子突变CCUS，若伴有额外突变，5年内发展为髓系肿瘤的概率高达95%。这些克隆状态的存在构成了AML中MRD检测的核心挑战：并非治疗后检测到的所有突变都代表残留白血病，某些变异可能标志着长期存在的CHIP克隆而非耐药的AML细胞。
AML的克隆动力学复杂。驱动突变在不同宿主中可能因预先存在的分子和微环境因素而表现出不同生物学行为。因此，在诊断时很难预测哪个亚群（无论是分子还是免疫表型定义的）将在诱导治疗后占主导或持续存在。一些在健康成人中观察到的典型AML相关基因（如TP53、ASXL1）变异过于普遍，无法作为可靠的MRD标志物。例如，2021年欧洲白血病网（ELN）MRD工作组明确不鼓励使用ASXL1突变用于此目的。未来，随着能够进行临床表观遗传谱分析的技术出现，单细胞分辨率下的甲基化和染色质状态评估可能阐明为何具有相同ASXL1突变的不同AML病例行为迥异。
由于当前临床实践中使用的分子工具是对样本进行批量分析，两个同时发生在一大半AML细胞群中的突变，与这两个突变相互排斥地各出现在一半细胞群中，会以相同方式被报告。这一现实造成了共定位挑战，而单细胞测序等新兴工具有望克服这一问题。
AML管理中MRD整合与研究的现有工具
尽管MRD检测和MRD适应性治疗方法已在多种血液恶性肿瘤中确立，但其融入AML临床管理的进程更为审慎。目前数据最有力支持MRD检测用于指导核心结合因子（CBF）AML、NPM1突变AML和FLT3突变AML的管理，这些亚型疾病特异性分子标志物明确，检测方法相对成熟。在这些情况下，强化治疗两个周期后和/或巩固治疗结束时的MRD阴性与改善的无复发生存期和总生存期持续相关。
美国国家综合癌症网络（NCCN）和ELN的专业指南建议，对特定分子亚组在定义的时间间隔进行MRD评估。两者均推荐将遗传学MRD评估与多色流式细胞术（MFC）并行纳入，尽管基于流式的MRD检测方法的解读框架尚未很好标准化。目前AML的分子MRD监测主要基于特定基因靶点的qPCR检测，如NPM1突变、RUNX1-RUNX1T1和CBFB-MYH11易位。NGS方法作为能够同时检测多个变异且灵敏度更高的工具正在积极研究中，但因其实验室间变异性和分析阈值的不确定性，尚未在研究方案之外被认可用于常规MRD监测。
2021年ELN关于AML中MRD检测的建议和2024年英国国家医疗服务体系（NHS）的指南等技术文件，强调了MRD检测方法必须经过验证，并明确报告检测下限（LLOD）、定量下限（LLOQ）以及阈值附近的不确定性。
现代AML中MRD检测的当代平台
遗传学和细胞遗传学检测构成了AML诊断的历史基础，其中许多平台正被探索用于MRD检测。这些工具不仅在分析灵敏度上不同，而且在它们能捕获的疾病生物学方面也存在差异。
细胞遗传学方法
常规核型分析检测培养骨髓细胞的中期染色体铺片，能够检测大的结构和数目染色体异常，但因分析中期数量有限（通常约20个），缺乏检测小残留群体或低频克隆的灵敏度。荧光原位杂交（FISH）利用针对特定基因组区域的荧光探针，可在单细胞水平识别异常，灵敏度比核型分析提高约十倍，但本质上是一种靶向技术，无法检测未提供探针的新发或意外异常。近年来，染色体微阵列分析（CMA）和光学基因组图谱（OGM）为基因组范围内的拷贝数和结构变异检测提供了额外工具。OGM是一种新兴工具，无需细胞培养即可快速检测全基因组细胞遗传学变化，早期研究表明它可能在诊断和MRD应用中成为强大工具。
PCR-based遗传学方法
PCR-based检测比细胞遗传学方法提供了显著提高的分析灵敏度，在存在合适靶点时仍是AML中MRD检测的支柱。传统的实时定量聚合酶链反应（qPCR）能够以通常约为万分之一（10-4）的灵敏度检测和量化预定义的转录本或突变。微滴式数字PCR（ddPCR）将合成反应分割成数千个微滴，允许在平行的微反应中进行扩增，从而无需标准曲线即可实现绝对定量，并将抑制物的影响降至最低。其灵敏度比标准qPCR提高约一个数量级（十倍）。尽管ddPCR检测尚未获得AML MRD监测的监管批准，但对FLT3和其他复发性突变的积极研究已显示出令人鼓舞的可行性。
二代测序方法
NGS技术已经改变了AML的诊断，目前代表了MRD检测方法开发中最有前景的途径之一。与需要预先定义特定测量靶点的经典PCR不同，NGS允许并行检测多个位点，并能检测已知和新发变异。用于MRD的NGS实施在技术上仍然复杂，因为必须调整众多分析因素以优化检测性能。NGS工具大致分为两类：使用合成测序（类似于PCR）的工具和依赖替代测序化学的工具。在这两类中，实验室可选择短读长测序（每个核酸片段读取数百个碱基对）或长读长测序（数千到数万个碱基对）。长读长平台可能在某些MRD设置中具有优势，因为它们避免了与扩增相关的系统误差，并且可以直接定位短读长方法遗漏的结构变异。由于成本更低和每碱基准确性更高，短读长方法目前使用和研究更广泛。
在NGS平台中，测序深度为可比性提供了重要工具。更高的测序深度增强了对低频变异的检测，但增加了成本和计算负担。一种可能的解决方案是，当NGS检测到介于LLOD和LLOQ之间的变异时，通过反射检测到更灵敏的检测方法（如qPCR）。
免疫表型方法
虽然遗传学检测提供了关于分子持续性的强大信息，但免疫表型（IP）工具对于在细胞水平表征残留疾病仍然不可或缺。目前专业学会指南建议将这些方法与遗传学和细胞遗传学工具并行使用，尽管人们对IP与分子评估的顺序使用越来越感兴趣。
多色流式细胞术（MFC）量化大量细胞表面和细胞内标志物的表达，能够识别罕见的异常群体。根据检测设计、标志物稳定性和操作者经验，现代检测的有效灵敏度约为10-3至10-4。MFC在临床诊断和MRD检测中的主要优势是速度快、可及性强，并能提供关于残留异常群体的实时信息。与疾病生物学相关的主要局限性包括假阳性（如再生骨髓）和细胞稀少标本中的假阴性。为了提高可重复性，ELN指南强调在所有MFC报告中包含LLOD和LLOQ值，并建议由经验丰富的血液病理学家进行详细的解读说明。
由于AML缺乏广泛表达的特异性表面标志物，目前通过MFC测量MRD信号建立了两种成熟方法：白血病相关免疫表型（LAIP）和不同于正常（DfN）方法。ELN现在建议结合这两种方法进行全面评估。LAIP方法监测诊断时确定的患者特异性异常标志物模式的持续性，而DfN方法识别其标志物组合落在正常造血模式之外的细胞。虽然尚未普遍采用标准组合来探测任一种MRD模式，但ELN指南建议在机构层面设计的组合中包含CD34、CD117、CD45、CD33、CD13、CD56、CD7和HLA-DR。
新兴的多模态方法
认识到前述单一检测方法和平台的局限性，一些新兴的多模态技术正成为那些希望同时利用多种检测类型优势以提升综合MRD性能的重要考虑方向。
其中一项有前景的发展是流式-FISH（Flow-FISH），它结合了FISH的探针特异性与流式细胞术的高通量细胞计数。这种混合方法通过分析数万个细胞（而非传统FISH检查的几百个）来检测低频事件。尽管Flow-FISH尚未应用于AML MRD，但其在多发性骨髓瘤中的可行性已得到证实。
将MFC和细胞分选与分子诊断相结合的平台，允许在NGS之前进行阳性或阴性细胞分选，以富集具有异常免疫表型的细胞。这种MFC与分子方法的整合提高了灵敏度，并允许将遗传变异定位于恶性群体，改善了信噪比，并澄清了检测到的突变是来自AML还是来自CHIP相关克隆。
最后，单细胞测序（SCS）代表了MRD检测的一个强大前沿，能够在单个细胞内评估基因型和表型。通过生成可追溯到由表面标志物定义的特定来源细胞的条形码核酸读取，单细胞DNA测序理论上可以在10,000个细胞中检测到一个白血病细胞，灵敏度接近10-4至10-5，尽管基因丢失和采样限制可能影响实际性能。SCS在AML中的原理验证应用已展示了其绘制克隆层次结构和识别复发驱动亚群的潜力，但这些尚未进入临床。与其他多模态工具一样，SCS提供的成果将增进我们对AML功能的理解，同时指导合理和个性化的患者治疗。
结论与展望
综上所述，AML MRD领域正处在临床证据、技术创新和生物学细微差别交汇的十字路口。来自大型学术和合作研究的数据证实，MRD阴性（在临床可评估的范围内）与一些重要患者亚群的生存改善相关。然而，检测标准化、解读框架和生物学验证方面的持续差距制约了其常规临床应用。
AML MRD评估的首要挑战之一在于区分真正的白血病持续存在与良性克隆性造血。年龄相关的克隆扩增，包括CHIP和CCUS，可能携带与驱动AML相同的突变。如果检测到的变异被误解为残留白血病，这种重叠可能导致假阳性MRD结果。相反，依赖狭窄的突变组合可能导致复发监测的假阴性，特别是当复发来自携带与诊断时不同的遗传病变的亚克隆时。
批量测序方法虽然强大，但提供的空间和克隆分辨率有限。它们无法确定多个突变是共存于同一细胞内还是存在于不同的亚克隆中。新兴的单细胞和阳性分选方法可能缓解这一局限性，但仍然费时费力且成本高昂。流式细胞术MRD检测的性能取决于对免疫表型库的假设，但治疗后表型漂移很常见。抗原表达的变化可能掩盖残留的白血病群体，或从再生骨髓中产生错误信号。
机构间检测灵敏度和报告实践的差异进一步使基于文献报告的MRD实施复杂化。即使经过充分验证的检测也仅在由其LLOD和LLOQ定义的可量化误差范围内运行。接近这些阈值的结果必须谨慎解读，特别是当微小变化可能影响重大治疗决策时。此外，MRD性能在很大程度上取决于样本质量和采集时机。治疗后的低细胞骨髓、血液稀释的穿刺物或延迟的样本处理都可能降低分析灵敏度。
AML MRD研究的未来进展将依赖于互补检测模式的整合。结合流式细胞术、PCR和测序（各自具有不同优势）的多模式策略可以提高灵敏度和特异性。随着Flow-FISH、测序前的流式细胞分选富集以及单细胞多组学分析等工具的成熟，它们不仅有望改进MRD检测，还将增进对AML克隆生物学和治疗耐药性的理解。那些被理论认为构成AML中自我更新和治疗耐药区室的“白血病干细胞”，尚未被充分了解以实现可靠表征或行为预测。AML中的晚期复发虽罕见但确有发生，病例报告显示其常携带先前治疗过疾病的特征性突变，这表明存在一种休眠状态，未来的MRD检测方法将致力于检测这种状态。
即使使用未来的MRD检测工具，MRD知情治疗方法对患者的益处如何，仍是一个经验性问题，取决于在每种情况下如何及何时评估此类标志物。有些标志物可能具有很好的预后功能，而另一些则具有预测功能，有时是由于非直观的统计现象。为了优化和扩展遗传学、细胞遗传学、表观遗传学、免疫表型和组合模式工具在该领域的应用，需要临床医生和实验室研究者持续合作，以实施更强大、更复杂的AML监测方法。
