《Advanced Science》：Highly Active Cu14 Cluster Precisely Activates Autophagy Inhibitor to Amplify Cuproptosis Immunotherapy
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为解决常规金属催化剂效率低、自噬抑制对免疫原性细胞死亡(ICD)的干扰以及自噬抑制剂非特异性递送导致的毒性等问题，研究人员利用原子级精确的富Cu+铜纳米簇，开展了Cu14介导的裂解反应协同诱导铜死亡相关ICD与局部自噬抑制以增强免疫治疗效果的研究。该工作成功构建了同源靶向的Cu14@CM体系，在肿瘤部位可释放铜离子触发铜死亡并原位催化激活自噬抑制剂前药，通过双重作用机制有效抑制肿瘤生长并激活强效抗肿瘤免疫应答，为前药激活和铜簇在免疫治疗中的应用提供了新策略。
在对抗癌症的战斗中，免疫疗法，特别是能唤起免疫系统“敌我识别”能力的免疫原性细胞死亡(ICD)，已成为一颗耀眼的明星。然而，狡猾的肿瘤细胞会启动名为“自噬”的自我清理程序，这种保护性自噬如同一个内部维修队，能清理受损部件，降低肿瘤细胞的免疫原性，帮助它们逃避免疫系统的追杀。虽然自噬抑制剂能破解这层防御，但传统的给药方式往往“敌我不分”，在抑制肿瘤自噬的同时也会对正常细胞造成伤害，带来显著的全身毒性。另一方面，利用过渡金属催化裂解反应在病灶局部激活前药，是降低毒副作用的一种精准策略。但目前的催化平台常常受限于非必需金属元素的引入和催化效率不高，影响了最终的治疗效果。
有没有一种材料，既能高效催化药物释放，本身又是治疗肿瘤的“武器”，还能精准找到肿瘤老巢，实现“一石多鸟”呢？近日，一篇发表在顶级期刊《Advanced Science》上的研究给出了一个令人振奋的答案。研究团队将目光投向了原子级精确的铜纳米簇。这类材料结构明确，催化活性高，更重要的是，铜本身是生命必需元素，其离子能诱发一种名为“铜死亡”(Cuproptosis)的新型程序性细胞死亡方式，且与ICD密切相关。研究人员设想，若能构建一个基于铜纳米簇的智能系统，让它靶向到达肿瘤后，一边释放铜离子引发铜死亡和ICD，一边高效催化裂解自噬抑制剂前药，阻断肿瘤的保护性自噬，就能形成一个强大的协同抗肿瘤免疫攻击波。
为了验证这一设想，研究人员巧妙设计并开展了一系列研究。关键技术方法包括：1) 合成与表征：合成了原子级精确的Cu14(C2B10H10S2)6(CH3CN)8纳米簇，并通过单晶X射线衍射等多种手段表征其结构、组成与光学性质。2) 仿生修饰：利用小鼠乳腺癌细胞(4T1)膜对Cu14簇进行包覆，构建具有同源靶向能力的Cu14@CM纳米复合体。3) 催化性能评估：在溶液体系和细胞内，系统评估了Cu14@CM催化裂解模型前药(Pro-Cou)和自噬抑制剂前药(PMA)的能力，并探究了其催化生成活性氧(ROS)的性质。4) 体外抗肿瘤机制研究：在4T1细胞中，综合运用细胞活力检测、免疫荧光、蛋白质印迹(Western Blot)、生物透射电镜(Bio-TEM)等技术，深入研究了Cu14@CM诱导铜死亡（通过DLAT蛋白寡聚化和铁硫簇(Fe-S)蛋白耗竭）、抑制自噬（通过监测LC3-II和p62蛋白）、以及触发ICD（通过检测CRT、HMGB1、ATP等DAMPs释放和树突状细胞成熟）的效果。5) 体内抗肿瘤与免疫评价：建立4T1荷瘤小鼠（皮下和原位模型），通过监测肿瘤生长、组织病理学分析、以及流式细胞术检测肿瘤浸润免疫细胞（如CD8+T细胞、CD4+T细胞、树突状细胞）等，全面评估了Cu14@CM的治疗效果、免疫激活能力和生物安全性。
2.1 Cu14纳米簇的结构与表征
研究人员成功合成并解析了Cu14纳米簇的单晶结构，其核心由一个规则的Cu6八面体单元和一个包裹该单元的Cu8立方框架构成，铜的氧化态主要为Cu+。该簇尺寸约为1.33纳米，在紫外可见吸收光谱中具有特征峰，并表现出红色荧光发射。
2.2 Cu14纳米簇的前药激活能力
研究表明，Cu14纳米簇在裂解模型前药Pro-Cou和自噬抑制剂前药PMA方面展现出优异且浓度/时间依赖性的催化活性，其性能显著优于CuSO4和CuBr。机制研究表明，催化过程始于炔基与铜核心的配位。同时，Cu14在酸性条件下还能有效催化过氧化氢(H2O2)产生羟基自由基(•OH)。
2.3 细胞内Cu14@CM介导的催化裂解反应
将Cu14包覆4T1癌细胞膜后，得到的Cu14@CM保持了原有的催化活性，并表现出良好的稳定性（在生理pH下）和酸响应性（在pH 4下快速释放铜离子）。细胞实验证实，Cu14@CM能被4T1细胞高效摄取并定位于溶酶体，且对同源肿瘤细胞具有选择性。更重要的是，在细胞内它依然能有效催化Pro-Cou的裂解反应，证明了其细胞内前药激活的可行性。
2.4 Cu14@CM的体外抗癌性能
细胞毒性实验表明，Cu14@CM联合PMA能产生最强的杀瘤效果。机制研究发现，Cu14@CM处理可导致细胞发生铜死亡，表现为脂酰化蛋白DLAT的异常寡聚化和Fe-S簇蛋白的耗竭。同时，Cu14@CM会诱导保护性自噬（LC3-II增加，p62减少）。而当与PMA联用时，Cu14@CM能将PMA催化转化为自噬抑制剂MA，从而有效抑制自噬，增强铜死亡的疗效。该过程还伴随活性氧生成和线粒体膜电位下降。
2.5 铜死亡介导的免疫原性细胞死亡(ICD)
研究证实，Cu14@CM诱导的铜死亡能够有效触发ICD，表现为损伤相关分子模式(DAMPs)如钙网蛋白(CRT)暴露、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)释放和三磷酸腺苷(ATP)分泌。当与PMA联用时，由于自噬被抑制，DAMPs的暴露进一步放大。在Transwell共培养模型中，经Cu14@CM（特别是PMA+Cu14@CM）处理后的肿瘤细胞上清，能显著促进树突状细胞的成熟（CD80/CD86表达上调），证明其成功激活了免疫应答。
2.6 Cu14@CM的体内治疗效果
在4T1皮下荷瘤小鼠模型中，Cu14@CM治疗能显著抑制肿瘤生长，而PMA+Cu14@CM组效果最佳。肿瘤组织分析显示治疗组出现DLAT聚集和FDX1表达下降，证实了铜死亡通路被激活。治疗期间小鼠体重稳定，主要器官未出现明显病理损伤，表明其良好的生物安全性。
2.7 Cu14@CM诱导的体内免疫应答
进一步的免疫学分析显示，PMA+Cu14@CM治疗能显著增加肿瘤组织中CRT的表达，促进树突状细胞成熟，并提高肿瘤内部和脾脏中CD4+和CD8+T细胞的浸润比例，同时降低调节性T细胞(Tregs)的比例，表明其成功激发了系统性的抗肿瘤免疫反应。
2.8 Cu14@CM的长期治疗效果
在为期21天的长期治疗实验中，PMA+Cu14@CM展现了强大且持久的肿瘤抑制效果，并显著延长了小鼠的生存期。组织学分析再次确认了其通过铜死亡和抑制自噬发挥作用的机制，以及引发的抗肿瘤免疫记忆。长期毒性评估未发现明显副作用。
2.9 原位肿瘤的体内治疗
在更贴近临床实际情况的4T1原位乳腺肿瘤模型中，PMA+Cu14@CM同样表现出优异的肿瘤靶向积累能力和显著的治疗效果，有效抑制了原位肿瘤的生长，并再次验证了其通过诱导铜死亡和抑制自ophagy起效的机制。
研究结论与意义
本项研究开创性地利用高活性、原子级精确的Cu14纳米簇介导键裂解反应，构建了一种“双功能”智能纳米治疗平台Cu14@CM。该平台成功实现了肿瘤微环境中的精准诊疗一体化：一方面，其酸响应性释放的铜离子可有效触发肿瘤细胞的铜死亡，并伴随免疫原性细胞死亡(ICD)；另一方面，其高效催化活性可原位激活自噬抑制剂前药，瓦解肿瘤的自我保护机制（保护性自噬），从而放大ICD信号。这种“诱导死亡”与“解除防御”的双重策略，协同增强了树突状细胞提呈抗原和细胞毒性T淋巴细胞浸润杀伤的能力，最终强化了全身抗肿瘤免疫应答。
这项工作的重要意义在于：1) 策略创新：首次将铜纳米簇的催化功能与铜死亡诱导功能相结合，为前药的局部精准激活提供了高效、安全的新方法。2) 机制深化：明确了通过抑制保护性自噬可有效增强铜死亡介导的ICD，深化了对铜死亡免疫调节机制的理解。3) 治疗增效：在皮下、原位等多种小鼠肿瘤模型中均展现出优异的治疗效果和免疫激活能力，为临床转化提供了有前景的候选方案。4) 领域拓展：推动了原子精确金属簇在生物医学，尤其是催化治疗和免疫治疗领域的应用边界，为开发基于金属簇的下一代智能抗癌药物奠定了坚实的基础。
