基于CRISPR-Cas12a和具有冷冻功能的金纳米颗粒（AuNP）的SARS-CoV-2快速可视化检测方法

《Microchemical Journal》：CRISPR-Cas12a and freezing-functionalized gold nanoparticles (AuNP)-based rapid visual detection of SARS-CoV-2

快速检测尖孢镰刀菌的RPA-CRISPR/Cas12a-LFD技术研究中，创新性地整合重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a系统，开发出可在1小时内完成、灵敏度达1fg的现场检测方法，显著提升田间病原体检测效率与特异性。

严雅琴|敖若兰|丁健|王武宏|胡海娇|胡天华|魏金珍|王金雷|王涛涛|鲍崇来

摘要

Fusarium solani是一种主要的植物病原真菌，可引起Fusarium根茎腐病，属于最具破坏性的土传病原体之一，对茄子种植构成威胁。开发快速、准确的F. solani现场检测方法对于及时管理病害至关重要。本研究提出了一种结合CRISPR/Cas12a技术和侧向流动试纸的重组酶聚合酶扩增（RPA）方法，并采用了一种新型的物种特异性目标基因，用于快速现场检测F. solani。值得注意的是，本研究开发的RPA-Cas12a-LFD检测方法对F. solani具有极高的特异性，能够在1小时内准确检测到目标病原体，并且检测限低至1 fg的F. solani基因组DNA。这些特性使得该检测方法成为传统方法的实用替代方案，既具备实验室级别的性能，又方便在现场使用，对于平衡诊断精度和农业应用性具有重要意义。

引言

Fusarium solani具有广泛的宿主范围，能够感染多种经济价值较高的作物，包括茄子[1]、马铃薯[2]、大豆[3]和生姜[4]。对于Solanaceous作物来说，F. solani是导致根腐病的主要病原体，会导致产量下降和产品质量下降。茄子（Solanum melongena）是一种全球重要的蔬菜作物[5]。引起Fusarium根茎腐病的Fusarium solani被认为是茄子中最具破坏性的土传病原体之一。在中国，这种病原体对农业生产构成重大威胁，典型发病率在10%–30%之间，在连续种植的情况下发病率甚至可超过50%[6]、[7]。在感染过程中，F. solani会在植物根部定殖，并在受感染的根组织中产生大量分生孢子和厚垣孢子，导致根表皮出现黄褐色坏死病斑，最终导致叶片萎蔫、植株倒伏并死亡[8]。由于F. solani能够以休眠的厚垣孢子形式在土壤中存活多年，即使在没有茄子宿主的情况下也能长期存在，因此它对茄子种植构成长期威胁，尤其是在轮作制度有限的密集种植系统中。及时准确地检测F. solani对于实施有效的病害管理策略、防止病害爆发和减少农业产量损失至关重要。然而，由于多种因素的影响，检测这种病原体仍然具有挑战性，这凸显了迫切需要先进可靠的检测技术。

传统的F. solani检测方法包括将样本直接接种在固体培养基上、聚合酶链反应（PCR）和实时定量PCR（qPCR）。然而，这些传统方法存在明显的局限性。直接接种需要最佳的培养条件和特定的培养基来诱导真菌结构的形成。通过这种方法进行形态学鉴定通常需要几周时间，而且准确区分不同的Fusarium物种较为困难——尤其是当田间茄子根部被多种Fusarium物种定殖时，难以确定真正的病原体复合体[9]。传统PCR可以鉴定物种，但无法有效量化样本中的各个物种。虽然qPCR比接种或传统PCR更高效、更敏感、更特异，但它仍然依赖于昂贵的热循环仪和熟练的操作人员，限制了其现场应用的可行性。相比之下，等温核酸扩增技术（如Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）解决了传统PCR检测方法的核心局限性[10]、[11]。它们能够在恒定温度下进行核酸扩增，从而方便用户在田间进行现场检测[10]。然而，这些技术的应用也存在一些挑战，最显著的是由于意外气溶胶污染或非特异性扩增导致的假阳性风险。

这些缺点表明需要一种更可靠的检测方法，将RPA与CRISPR/Cas12a技术相结合，可以提高检测的准确性、速度、灵敏度和便捷性[13]、[14]。重组酶聚合酶扩增（RPA）能够在恒定温度（37–42 °C）下利用多种酶实现核酸的指数级扩增，成为核酸检测的潜在替代方案[15]。它仅使用一对引物就能在约30分钟内产生可检测的扩增产物，无需复杂设备[16]，非常适合即时检测或初级快速诊断[17]。CRISPR-Cas系统基于规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas12a），是一种广泛应用于病原体检测的多功能核酸检测工具[18]。Cas12a是一种II类V型CRISPR效应蛋白[19]，通过crRNA引导的protospacer adjacent motif（PAM）结合识别目标DNA，切割双链目标DNA，并激活单链DNA（ssDNA）的切割[20]。这一特性使得检测成为可能：切割荧光团-淬灭剂ssDNA（例如FAM-ssDNA-BHQ1）会释放荧光信号；使用FAM-ssDNA-Biotin可以通过IgG/链霉亲和素结合实现金纳米颗粒条带检测（T/C线），从而指示RPA扩增产物[21]、[22]、[23]。迄今为止，该系统已成功用于检测多种病原真菌，包括F. verticillioides [24]、F. fujikuroi [25]、Phytophthora sojae [26]、Alternaria triticina [27]、[28]、Plenodomus libanotidis [29]和Diaporthe aspalathi [30]。然而，RPA-CRISPR/Cas12a-LFD技术尚未应用于F. solani>的检测。

本研究通过将RPA-CRISPR/Cas12a-LFD技术与新发现的物种特异性目标基因结合，建立了一种快速的F. solani可视化检测系统，整个检测过程可在1小时内完成。通过使用F. proliferatum、F. incarnatum、F. commune、F. fujikuroi、F. oxysporum以及其他卵菌分离株进行交叉反应测试，验证了该检测方法的特异性。同时，通过人工接种样本进一步验证了该方法的分析灵敏度和实际应用性。这项研究将为茄子根腐病的综合管理提供科学依据，促进可持续农业实践的发展。所开发的检测策略也可以作为检测其他Fusarium物种的模板，扩大其在农业病害管理中的影响。

部分内容片段

真菌菌株来源

本研究使用的真菌菌株来自浙江省各地患病茄子的根部和叶片，所有菌株均保存在浙江省蔬菜种质创新与品质改良重点实验室（表S1）。所有菌株均通过形态特征观察结合内部转录间隔区（ITS）和翻译延伸因子1α基因（TEF-1α）的部分序列分析进行鉴定。

基因组DNA提取

RPA CRISPR/Cas12a检测系统FS的原理和工作流程

使用集成RPA-CRISPR/Cas12a系统检测F. solani的工作流程和机制如图1所示。简而言之，从F. solani感染的植物组织中提取的粗基因组DNA经过RPA检测，该检测为单步等温反应。在基于RPA-CRISPR/Cas12a的荧光检测模块中，RPA扩增产物由Cas12a/sgRNA复合物特异性识别，从而激活Cas12a的转切割活性进行水解

讨论

F. solani是一种对茄子具有破坏性的土传病原体，潜伏期长且难以检测，导致全球茄子生产区遭受严重的经济损失。这种病原体不仅因其形态和遗传特征与密切相关的Fusarium物种相似而带来诊断挑战，还给全球茄子生产系统带来了巨大的经济损失。在致病性方面，F. solani具有广泛的感染范围

结论

本研究建立了一种结合RPA、CRISPR/Cas12a和LFD的快速检测方法，用于现场识别F. solani>，该方法被命名为RPA-CRISPR/Cas12a-LFD检测系统。该检测系统的显著优势包括高特异性、高灵敏度和短检测时间。检测结果以T线和C线的形式在试纸上显示，无需昂贵的设备，便于早期检测F. solani。

CRediT作者贡献声明

严雅琴：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学研究，资金获取。敖若兰：撰写 – 原始草稿，实验研究，数据分析。丁健：项目管理，资金获取，数据管理。王武宏：数据分析，数据管理。胡海娇：数据分析，数据管理。胡天华：验证，数据分析。魏金珍：资源提供。王金雷：方法学研究。王涛涛：项目管理。鲍崇来：监督，资源提供，

伦理审批和参与同意

不适用。

未引用参考文献

[12]

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了浙江省重大协作推广计划（2025ZDXT06-01-->）、国家自然科学基金（32402598-->）和浙江省重大科技项目的新品种培育计划（2021C02065-->）的支持。