裂谷热疫苗候选株在妊娠啮齿动物模型中的评估

《Vaccine》：Evaluation of Rift Valley fever vaccine candidates in pregnant rodent models

本研究评估了rMP-12和RVax-1疫苗在怀孕SD大鼠和C57BL/6小鼠中的胎盘组织嗜性及胎儿影响。结果显示，大鼠中两种疫苗的胎盘和胎儿组织病毒复制有限，表明垂直传播风险低；而小鼠中病毒在胎盘和胎儿组织中被检测到，rMP-12导致胎儿数量减少和胎盘组织自溶，RVax-1则引发胎儿死亡，提示物种特异性差异。

Cigdem Alkan|Eduardo Jurado-Cobena|Tetsuro Ikegami

德克萨斯大学加尔维斯顿医学分部病理学系，301 University Blvd., 加尔维斯顿, TX 77555, 美国

摘要

背景

裂谷热病毒（RVFV）对人类和牲畜会造成严重疾病。候选疫苗rMP-12和RVax-1的免疫原性显示出潜力，但它们对胎盘的亲和力及其对胎儿结果的潜在影响仍不完全清楚，尤其是在不同的动物模型中。了解特定物种的胎盘复制机制对于优化孕妇群体的疫苗安全性至关重要。

目的

评估RVFV候选疫苗rMP-12和RVax-1在怀孕的Sprague–Dawley（SD）大鼠和C57BL/6小鼠中的胎盘亲和力及胎儿结果。

方法

怀孕的SD大鼠和C57BL/6小鼠在胚胎第14天（E14）通过肌肉注射1 × 10⁵或1 × 10⁶ PFU的rMP-12或RVax-1。使用病毒RNA定量和抗原检测方法，在大鼠的E18天以及小鼠的E17天或E19–21天评估病毒在母体、胎盘和胎儿组织中的复制情况。记录胎儿结果，包括产仔数、胎盘组织病理学和胎儿死亡情况。

结果

在大鼠中，两种疫苗在胎盘和胎儿组织中的复制都很少，表明垂直传播有限。相比之下，小鼠更容易受到感染：在母体肝脏、胎盘和胎儿部分都检测到了病毒RNA和抗原。接种rMP-12疫苗的小鼠产仔数减少，胎盘组织发生自溶；而接种RVax-1疫苗的小鼠出现胎儿死亡，病毒抗原在交界区和迷路区的海绵滋养层细胞、合胞滋养层细胞和滋养层巨细胞中被检测到。

结论

RVFV疫苗rMP-12和RVax-1在小鼠中表现出残余的胎盘亲和力，但在大鼠中复制极少，这突显了物种间的差异。小鼠模型可能有助于研究胎盘亲和力，这些发现有助于未来优化妊娠期间的疫苗安全性。

引言

裂谷热（RVF）是一种由蚊子传播的人畜共患病，主要发生在撒哈拉以南非洲、埃及、马达加斯加、科摩罗、沙特阿拉伯和也门，影响人类和牲畜，包括羊、牛、山羊和骆驼[1]。在RVF暴发期间，受感染的怀孕绵羊、牛和山羊会出现高流产率、胎儿死亡和先天畸形，这些情况通常先于人类病例的发生。此外，新生动物的死亡率显著升高。人类RVF病例最常见的表现是自限性发热性疾病；然而，部分患者会出现严重症状，包括病毒性视网膜炎、脑炎或出血热[2]。裂谷热病毒（RVFV）属于Phlebovirus属，属于Phenuiviridae科，是一种负链RNA病毒，其基因组由大（L）、中（M）和小（S）三个片段组成[3]。L片段编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶，M片段编码一种糖蛋白前体，该前体在翻译过程中被切割成Gn和Gc蛋白，以及78-kDa蛋白和非结构蛋白M（NSm），S片段编码核蛋白（N）和非结构蛋白S（NSs）。RVFV被美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）列为A类优先病原体，也被美国卫生与公共服务部（HHS）和美国农业部（USDA）列为重点监测病原体[4],[5]。此外，RVFV被世界卫生组织（WHO）列为研发蓝图中的原型病原体，作为流行病准备的模型，并被列入世界动物卫生组织（OIE）的通报疾病[6],[7]。

在多个流行国家已有针对RVF的兽用疫苗，包括减毒活疫苗Smithburn和Clone 13。然而，RVF暴发往往难以预测，由于疫苗接种成本较高且暴发频率相对较低（相对于牲畜的更替速度），因此尚未广泛实施常规疫苗接种。因此，对易感牲畜进行常规疫苗接种（最好使用能提供长期免疫力的疫苗）对于减少未来RVF暴发的影响至关重要。

介绍

裂谷热（RVF）是一种蚊子传播的人畜共患病，主要发生在撒哈拉以南非洲、埃及、马达加斯加、科摩罗、沙特阿拉伯和也门，影响人类和牲畜，包括羊、牛、山羊和骆驼[1]。在RVF暴发期间，受感染的怀孕绵羊、牛和山羊会出现高流产率、胎儿死亡和先天畸形，这些情况通常先于人类病例的发生。此外，新生动物的死亡率也显著升高。人类RVF病例通常表现为自限性发热性疾病；然而，部分患者会出现严重症状，包括病毒性视网膜炎、脑炎或出血热[2]。裂谷热病毒（RVFV）属于Phlebovirus属，属于Phenuiviridae科，是一种负链RNA病毒，其基因组由大（L）、中（M）和小（S）三个片段组成[3]。L片段编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶，M片段编码一种糖蛋白前体，该前体在翻译过程中被切割成Gn和Gc蛋白，以及78-kDa蛋白和非结构蛋白M（NSm），S片段编码核蛋白（N）和非结构蛋白S（NSs）。RVFV被美国国家过敏和传染病研究所（NIAID）列为A类优先病原体，也被美国卫生与公共服务部（HHS）和美国农业部（USDA）列为重点监测病原体[4],[5]。此外，RVFV被世界卫生组织（WHO）列为研发蓝图中的原型病原体，作为流行病准备的模型，并被列入世界动物卫生组织（OIE）的通报疾病[6],[7]。

在多个流行国家已有针对RVF的兽用疫苗，包括减毒活疫苗Smithburn和Clone 13。然而，RVF暴发往往难以预测，由于疫苗接种成本较高且暴发频率相对较低（相对于牲畜的更替速度），因此尚未广泛实施常规疫苗接种。因此，对易感牲畜进行常规疫苗接种（最好使用能提供长期免疫力的疫苗）对于减少未来RVF暴发的影响至关重要。尽管目前尚无获准用于人类的RVF疫苗，但有几种候选疫苗正在研发中，包括RVFV-4s（四片段重组RVFV）、DDVax（编码NSs和NSm基因双缺失的重组ZH501菌株）和ChAdOx1-GnGc（一种编码RVFV GnGc的改良复制缺陷黑猩猩腺病毒载体），这些疫苗已进入1期或2期临床试验[8],[9]。在美国，一种福尔马林灭活的RVF疫苗（TSI-GSD-200）已在1/2期临床试验中进行了评估[10],[11],[12]。然而，该疫苗的免疫原性较低，需要多次初次接种和定期加强接种才能获得并维持保护性免疫。此外，其生产需要高防护级别的制造设施，这凸显了投资替代疫苗平台的必要性。自20世纪80年代以来，减毒活疫苗MP-12在动物和人类中得到了广泛研究，证明其在健康非孕妇中的安全性良好，单次接种即可产生长期保护性免疫[13],[14]。MP-12疫苗于2013年获准用于兽医用途[15]，疫苗主种子库用于紧急情况[16]。MP-12菌株是通过在含有5-氟尿嘧啶的条件下，将致病性Zagazig Hospital (ZH)548菌株在人类二倍体胎儿肺纤维细胞（MRC-5）中连续传代获得的，该菌株在基因组中具有23个突变：4个在S片段，9个在M片段，10个在L片段。MP-12的减毒表型主要归因于M片段中的两个氨基酸替换（Gn-Y259H和Gc-R1182G）和L片段中的两个氨基酸替换（L-V172A和L-M1244I）[17]。

尽管MP-12在羊胎盘组织（包括绒毛膜、尿囊膜和绒毛）中的复制能力低于致病性ZH501菌株[18]，但在妊娠30–50天时接种MP-12的怀孕母羊在妊娠18–20周时出现胎儿死亡，胎儿大脑中检测到微量的RVFV RNA[19]。同样，17只在妊娠早期接种了arMP-12ΔNSm21/384疫苗的怀孕母羊（该疫苗编码78kD和NSm基因的缺失）产下了三只畸形的新生羔羊[20]。由于MP-12和arMP-12ΔNSm21/384在妊娠晚期接种时均未在怀孕母羊中引起可检测的不良反应，因此MP-12观察到的不良反应可能仅限于妊娠早期接种。同样，接种Clone 13疫苗的母羊也出现了胎儿畸形和死产，新生羔羊中检测到病毒RNA[21]。

RVax-1是一种基于MP-12的下一代减毒活疫苗，通过反向遗传学技术制备。该疫苗包含了78kD和NSm基因的缺失，以及MP-12背景中的566个沉默突变[22]。这些修改旨在限制病毒在蚊子中的传播，并在疫苗菌株中引入遗传标记，以便在实地使用中监测潜在的溢出事件。RVax-1在小鼠中显示出的保护效果与rMP-12相当，而其在蚊子中的传播能力较低[22]。然而，有必要相对于亲本rMP-12菌株来评估RVax-1在怀孕动物中的减毒表型。

在怀孕母羊中的研究提供了关于疫苗减毒性的最相关信息，但这些研究耗时且成本较高。鉴于这些限制，开发一种更简单、更快速的实验方法来筛选RVax-1疫苗的减毒水平是有利的，理想情况下可以与之前的MP-12数据进行比较。先前的研究表明，怀孕的Sprague Dawley（SD）大鼠在胚胎第14天（E14）对致病性ZH501菌株高度敏感，导致超过50%的母体死亡、死产、幼崽发育异常以及母体和胎儿组织中的广泛病毒复制[23]。在E14时接种减毒活疫苗DDVax的SD大鼠没有出现临床症状，并产下了健康的幼崽[24]，表明像SD大鼠这样的啮齿动物模型可用于评估妊娠期间的疫苗减毒效果。虽然绵羊模型被认为是评估RVF疫苗安全性的金标准，但使用怀孕啮齿动物模型的研究可能提供补充信息以支持安全性评估。

在这项研究中，我们旨在评估RVax-1和亲本rMP-12菌株在SD大鼠和C57BL/6小鼠中的胎盘亲和力。评估病毒在胎盘和胎儿组织中的复制和分布情况对于疫苗安全性至关重要，因为垂直传播或胎盘感染可能在妊娠期间带来显著风险。鉴于它们对RVFV的相对高敏感性，我们假设怀孕的C57BL/6小鼠可能是一个敏感的模型，可以揭示在不太敏感的动物模型中可能未被发现的疫苗菌株的残余毒力或组织亲和力。

章节片段

介质、细胞和病毒

MRC-5细胞（人类二倍体胎儿肺纤维细胞，ATCC CCL-171）和Vero细胞（来自Chlorocebus属的非洲绿猴肾上皮细胞，ATCC CCL-81）在37°C、5% CO₂条件下培养于含有10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 μg/ml）的Dulbecco改良最小必需培养基中。重组MP-12菌株（rMP-12）和RVax-1菌株通过反向遗传学技术从Vero细胞中恢复，具体方法如前所述[22],[25]。这两种病毒

怀孕Sprague Dawley大鼠中rMP-12和RVax-1的轻微胎盘亲和力

为了评估rMP-12和RVax-1在SD大鼠（每组2只母鼠）中的胎盘亲和力，怀孕动物在E14天通过肌肉注射接受PBS，剂量为1 × 10⁵ PFU（母鼠#1和#2）或1 × 10⁶ PFU（母鼠#3和#4）的rMP-12，或1 × 10⁵ PFU（母鼠#5和#6）或1 × 10⁶ PFU（母鼠#7和#8）的RVax-1（表1）。在之前的研究中，1 × 10⁵ PFU的剂量常用于rMP-12疫苗接种，而1 × 10⁶ PFU被认为是高剂量[13]。这些动物的体重变化见

讨论

本研究评估了在怀孕SD大鼠和C57BL/6小鼠中E14天肌肉注射RVFV rMP-12或RVax-1候选疫苗的结果。尽管已有报道表明MP-12和arMP-12ΔNSm21/384候选疫苗在妊娠早期接种时会对怀孕母羊产生不良反应[19],[20]，但它们在替代啮齿动物妊娠模型中的评估尚未报道。致病性ZH501菌株在C57BL/6小鼠中会导致100%的死亡率，而怀孕SD大鼠

CRediT作者贡献声明

Cigdem Alkan：撰写 – 审稿与编辑、验证、调查、数据分析。Eduardo Jurado-Cobena：撰写 – 审稿与编辑、验证、调查。Tetsuro Ikegami：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、项目管理、方法学、调查、资金获取、数据分析、概念化。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了ChatGPT（OpenAI, GPT-4）来协助语言编辑和措辞。作者随后根据需要审查和修改了内容，并对最终版本的手稿负全责。

资金

本研究得到了NIH/NIAID R01 AI150917（T.I.）、NIAID新兴和热带传染病培训计划的Pre-Doctoral Fellowship（E.J.C.）（资助编号T32 AI007526，Lynn Soong）以及UTMB的Sealy疫苗科学研究所（SIVS）的慷慨资助。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Tetsuro Ikegami拥有授予德克萨斯大学加尔维斯顿医学分部的专利#US11643640B2。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢UTMB的解剖病理实验室和动物资源中心提供的技术支持。本研究部分得到了UTMB的Sealy疫苗科学研究所（SIVS）的资助。