《GM Crops & Food》：Screening method for detection of genetically modified soybean and maize events using multiplex PCR combined with capillary electrophoresis
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为解决转基因作物阳性对照获取受限、事件特异性检测难以大规模快速筛查的问题，研究人员开展了基于标准质粒的多重PCR结合毛细管电泳检测方法研究。他们成功构建了包含多种外源基因序列的标准质粒，建立了大豆和玉米的多重PCR检测体系，并验证了该平台的准确性与高分辨检测能力。该研究为口岸检验和转基因作物监控提供了一种经济高效、灵敏可靠的快速筛查平台。
近年来，转基因作物的种植和商业化应用在全球范围内持续增长。随着生物技术的进步，截至2025年5月，已有32种作物的641个转基因事件获得了安全批准，其中玉米和大豆分别以307个和56个事件占据主导地位。这些作物在全球贸易中扮演着核心角色，也使得在国际运输过程中接触它们的潜在风险增加，对高效、准确的口岸检测方法提出了迫切需求。传统的检测方法依赖于难以获取的认证参考物质作为阳性对照，且多针对特定转基因事件进行检测，难以满足大规模样本快速初步筛查的需求。这成为了监管链条中亟待解决的关键瓶颈。
针对这一挑战，发表在《GM Crops》上的这篇研究，提出了一种创新的解决方案。研究人员开发了一种基于外源基因的筛查策略，利用自行构建的标准质粒作为阳性对照，并结合了多重PCR和毛细管电泳技术。其核心思路在于，通过设计针对不同外源基因（如启动子、终止子和靶基因）的特异性引物，构建一套基因组合“矩阵”，用于在一次反应中同时检测多个目标，并能够初步区分不同的转基因事件。这不仅绕过了传统阳性对照的获取限制，还大幅提升了筛查的通量和效率。该研究为转基因大豆和玉米的边境检验提供了一种兼具高效率和成本效益的筛查新工具。
为验证此策略，研究人员主要运用了几个关键技术。一是基于生物信息学设计并合成了特异性引物。他们从公共数据库中获取了18种常见的外源基因序列信息，包括4个启动子、6个终止子和8个靶基因，并设计出用于常规PCR和多重PCR的引物对。二是标准质粒的构建与应用。他们以pBHA为载体，分别构建了针对大豆和玉米检测的两种标准质粒，其中嵌入了9-11个关键的、可区分不同转基因事件的外源基因片段，以此作为稳定、可重复的阳性对照。三是多重PCR体系的优化。他们设计了针对大豆和玉米的三组多重PCR引物体系，每组包含3-4对引物，并通过优化引物浓度来确保多个靶点能同时、均衡地扩增。四是毛细管电泳技术。与传统的琼脂糖凝胶电泳不同，研究人员利用毛细管电泳对多重PCR产物进行分析。该技术分辨率极高，能够区分仅相差几个碱基对的DNA片段，并可在约4分钟内完成单个样本的分析。实验所涉及的转基因大豆和玉米参考物质购买自比利时的IRMM，非转基因作物则购自韩国的一种子公司。
3.1. 针对转基因作物的外源基因检测系统的建立
研究者建立了基于18个外源基因标记的检测系统。与只能检测单一特定事件的事件特异性引物相比，该外源基因检测系统可定性检测多种转基因作物，覆盖面更广。通过组合使用9-11个标记，构建了针对特定作物的检测系统，使其能够在筛查层面根据标记组合来分类转基因事件。利用单重PCR成功验证了所构建的两种标准质粒包含了所有18个目标序列，并得到预期大小的扩增产物。
3.2. 构建作为阳性对照的标准质粒
为了解决转基因参考物质稀缺和使用受限的问题，研究团队设计了包含外源基因序列的标准质粒作为阳性对照。所选择的基因旨在能有效区分不同的转基因事件，使得检测系统能够通过PCR分析预测样品中的转基因事件。这些标准质粒通过转化扩增并纯化，最终用于PCR分析。
3.3. 利用多重PCR筛选12个转基因大豆事件
研究人员为大豆设计了三个多重PCR引物组合，成功地对12个转基因大豆事件进行了筛选。通过使用大豆内源基因Lec1引物确认了样品的大豆物种来源。使用三个大豆多重PCR引物组（Soy I, II, III）进行扩增，所得条带大小与预期一致，而非转基因大豆样品未检测到任何条带，证实该系统可有效区分转基因与非转基因大豆，并能初步推测事件类型。
3.4. 利用多重PCR筛选6个转基因玉米事件
采用与大豆相似的策略，研究者利用构建的玉米标准质粒，通过三个玉米多重PCR引物组合对6个转基因玉米事件进行了检测。通过玉米内源基因SSIIb引物确认了样品的玉米物种来源。使用玉米I、II、III引物组合进行扩增，结果与预期相符，非转基因玉米无交叉反应。所有引物对均设计为产生小于500bp的扩增产物，并经过验证以确保特异性，避免在其他非目标植物物种中产生非特异性扩增。
3.5. 基于毛细管电泳的转基因作物快速筛查
将多重PCR扩增产物进行毛细管电泳分析。结果显示，毛细管电泳能够清晰地区分不同大小的片段，包括在琼脂糖凝胶上难以区分的、大小相近的片段，如T-pinII (131 bp) 和csr1-2 (157 bp)。与传统的琼脂糖凝胶电泳相比，毛细管电泳无需制备凝胶，分析速度快（每个样品约4分钟），分辨率高（可区分1-4 bp的差异），灵敏度高，是快速DNA分析的高效工具。
3.6. 标准质粒的灵敏度
通过对标准质粒进行梯度稀释，评估了系统的检测灵敏度。结果显示，随着质粒浓度降低，信号强度逐渐减弱。在大豆质粒检测中，DMO基因在低浓度下的检测信号相对其他靶点有所减弱，这归因于多重PCR中引物间的竞争和扩增效率差异。尽管如此，在大多数国家采用的0.5%-5%的GMO阈值水平下，所有靶点都能被稳定检测。
综上所述，本研究通过整合外源基因多重PCR、毛细管电泳和标准质粒系统，建立了一个用于转基因大豆和玉米的高通量筛查平台。该系统采用矩阵式筛查策略，可在初步筛查阶段就推断潜在的转基因事件。标准质粒的构建提供了可靠的阳性对照，减少了对认证参考物质的依赖，也减少了不必要的事件特异性验证测试。多重PCR与毛细管电泳的结合实现了多个靶点的同时检测和高分辨率分离，即使在片段大小差异很小的情况下也能清晰分辨。该研究建立了一个稳健且可扩展的转基因作物筛查框架，为转基因作物的口岸检验和生物安全管理提供了一种兼具高准确性、高效率和经济性的新方案。
