《GM Crops & Food》：CRISPR/Cas gene editing for plant resistance to pests, diseases, and herbicide: application, risk assessment, and safety evaluation
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这篇综述系统阐述了CRISPR/Cas系统在主要粮食作物（水稻、小麦、玉米、马铃薯、大豆）中，通过精准编辑宿主易感(S)基因、害虫关键基因或除草剂靶标基因，从而赋予抗虫、抗病、抗除草剂性状的应用与突破。文章不仅探讨了其巨大潜力，也深入分析了脱靶效应、外源基因残留等生物安全风险，并比较了不同国家对基因编辑作物的监管政策演变。该文为这一前沿技术在作物改良中的负责任开发与应用提供了全面概览。
引言：应对粮食安全挑战的新工具
全球粮食安全正面临来自虫害、病害和除草剂影响的严重威胁。为满足到205年全球人口增长至96亿所需的粮食增产60%目标，开发新的作物改良工具势在必行。CRISPR/Cas系统作为一种无需转基因整合的精准基因组编辑技术，自2013年首次在植物中应用以来，已彻底改变了植物科学研究和作物改良策略。它通过程序化的RNA引导，在基因组特定位点诱导DNA双链断裂(DSB)，进而通过易出错的非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)途径实现基因敲除或精准修饰。近年来，碱基编辑器(BEs)和先导编辑器等新兴平台，甚至可以在不产生双链断裂的情况下实现精确的核苷酸转换，进一步扩展了其技术能力。然而，该技术在水稻、小麦、玉米、马铃薯和大豆这五种主要作物中的应用，仍面临公众接受度和监管不确定性的挑战。
通过基因编辑增强作物抗虫性
昆虫是造成全球作物损失的主要原因，既是直接害虫，也是植物病害的传播媒介。利用CRISPR/Cas技术，可以通过两种主要策略来管理虫害：编辑植物自身的基因，或直接编辑害虫的基因。
在植物基因组编辑方面，核心策略是敲除宿主的易感(S)基因。例如，在水稻中，敲除编码色氨酸脱羧酶的OsCYP71A1基因可以抑制血清素的生物合成，从而增强对褐飞虱(Nilaparvata lugens)和二化螟(Chilo suppressalis)的抗性。敲除OsLRR2基因能同时增强对褐飞虱和稻瘟病的抗性。更有趣的是，敲除负调控木质素合成的转录因子基因OsWRKY36，能同时提高对多种飞虱、稻瘟病和白叶枯病的抗性，并改善产量性状，实现了抗性与产量的协同提升。木质素作为物理屏障，其合成通路中的基因如OsPAL也是重要靶点。此外，通过多重编辑技术，可以一次性敲除多个基因，实现抗性性状的叠加。例如，同时编辑ACS2（抗褐飞虱）、Bsr-D1、ERF922、Pi21（抗稻瘟病）和Xa5（抗白叶枯病），获得了对三种病虫害均具抗性且农艺性状未受影响的品系。在玉米中，敲除苯并恶嗪类(BZX)防御代谢物生物合成的抑制因子基因ZmPP2C45，能显著提高BZX含量并抑制害虫生长。在大豆中，GmCDPK38和GmUGT基因的突变能提高对常见切根虫和棉铃虫的抗性。
编辑也可能产生意想不到的有益结果。例如，敲除茉莉酸(JA)信号通路负调控因子JAZ10时，一种特定的移码突变产生了一种新的蛋白FJ10，它通过调节DELLA和PAL通路，同时增强了水稻生长和对褐飞虱的抗性，解决了生长与防御之间的权衡矛盾。
在昆虫基因组编辑方面，策略旨在通过改变害虫的关键行为或生理来控制其种群。例如，利用CRISPR/Cas9敲除褐飞虱的味觉受体基因NlugGr23，会导致突变雄虫无法识别同型雌虫的信息素，从而避免交配，最终导致产卵不育。敲除其嗅觉受体辅助蛋白基因Orco，会使昆虫丧失对植物气味和性信息素的感知能力。针对鳞翅目害虫如棉铃虫(Helicoverpa armigera)，编辑其ABCC2、HaCad等基因可产生对Bt毒素Cry1Ac/Cry2Ab的高水平抗性，这反过来有助于研究害虫的抗性机制。编辑与胚胎发育(Slabd-A)、表皮硬化(AiTH)或杀虫剂靶标(RyR)相关的基因，可导致害虫死亡或发育异常。这些研究为开发基于基因驱动的种群控制新策略奠定了基础。
通过基因编辑增强作物抗病性
与引入抗性(R)基因的传统策略不同，利用CRISPR/Cas敲除宿主的易感(S)基因，为开发具有广谱、持久抗病性的作物提供了新途径。
在水稻中，白叶枯病是重要病害。病原菌Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Xoo)通过分泌效应因子诱导宿主SWEET基因表达，促进病害发展。通过编辑OsSWEET11、SWEET13、SWEET14等基因的启动子区，可以破坏效应因子的结合，从而赋予对白叶枯病的广谱抗性。编辑Xa13基因的启动子区，或敲除负调控因子基因OsERF922，也能显著增强抗性。通过多重编辑同时敲除Bsr-d1、Pi21和ERF922，可获得对稻瘟病和白叶枯病的双重抗性。
在小麦中，通过同时敲除三个同源拷贝，成功编辑了多个S基因以对抗不同病害。敲除MLO基因赋予了对白粉病的广谱抗性，但早期版本伴随早衰和减产；而新发现的Tamlo-R32等位基因或通过CRISPR/Cas9创造的类似编辑，则能在抗病的同时不牺牲产量。敲除负调控因子EDR1也能增强白粉病抗性。对于小麦条锈病，首次鉴定并敲除了易感基因TaPsIPK1，赋予了同时对条锈病和叶锈病的广谱抗性。敲除TaCIPK14基因也能提高对条锈病的抗性。对于病毒病，敲除TaPDIL5-1基因赋予了对抗黄花叶病毒病(WYMV)的抗性，而敲除Importin-α基因则增强了对黄矮病的抗性。对于赤霉病(FHB)，敲除被毒素 DON 上调的TaNFXL1基因提高了抗性。
在玉米中，敲除ZmGDIα-hel或ZmNANMT基因增强了对抗粗缩病(MRDD)的抗性。敲除LOX3基因降低了对黑粉病菌(Ustilago maydis)的感病性。在茉莉酸信号通路中，突变coi1a基因增强了对茎腐病(GSR)的抗性，而突变jaz15则增加了感病性。
在马铃薯中，晚疫病是毁灭性病害。通过CRISPR/Cas9同时编辑多个S基因，发现敲除StDND1、StCHL1或StDMR6-1的所有四个等位基因能显著增强对晚疫病的抗性，其中StDMR6-1突变体还表现出对早疫病、疮痂病的抗性，且不影响产量。此外，通过同源重组修复StCCoAOMT基因的功能缺失突变，恢复了木质素合成，也增强了抗病性。
在大豆中，通过敲除疫霉菌效应因子的宿主靶标基因，成功增强了对根腐病的抗性。突变应激反应基因GmARM则能同时提高对盐碱胁迫和疫霉菌的抗性。
通过基因编辑赋予作物抗除草剂性状
开发抗除草剂种质是应对杂草压力、保障产量的有效手段。CRISPR/Cas技术能够通过对内源除草剂靶标基因进行精准编辑，快速创制抗除草剂作物，且无需引入外源基因。主要靶标包括乙酰乳酸合酶(ALS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。
对于ALS抑制剂类除草剂（如磺酰脲类、咪唑啉酮类），通常通过在ALS基因特定位点引入点突变来赋予抗性。在水稻、小麦、玉米、马铃薯和大豆中，利用碱基编辑器(BE)或先导编辑器(PE)成功引入了如P178S、W542L、S621I等已知抗性突变，创制了抗氯磺隆、双草醚等除草剂的品系。同源重组(HDR)策略也被用于实现精准的等位基因替换。
对于ACCase抑制剂类除草剂（如芳氧苯氧丙酸酯类），通过腺嘌呤碱基编辑器(ABE)在水稻OsACCase基因引入C2186R突变，或利用双碱基编辑系统进行饱和突变筛选发现新突变位点W2125S，赋予了对抗禾草灵等除草剂的抗性。在小麦中，也通过编辑ACCase基因获得了抗性。
对于草甘膦（靶向EPSPS），策略包括利用NHEJ途径在OsEPSPS基因引入TIPS双氨基酸替换，或通过HDR进行精确的点突变。使用扩展PAM范围的碱基编辑器如STCBE-2，能够对OsEPSPS基因进行近饱和突变，筛选出抗草甘膦的突变体。
基因工程作物的生物安全考量
非预期脱靶效应
CRISPR介导的编辑可能产生gRNA依赖性或gRNA非依赖性的脱靶编辑。在植物中，全基因组测序分析表明，标准的CRISPR/Cas系统引起的gRNA非依赖性脱靶突变并不显著。然而，某些碱基编辑器(CBE)由于其胞嘧啶脱氨酶在单链DNA上的不受控活性，可能导致广泛的gRNA非依赖性脱靶突变。在多倍体作物（如六倍体小麦）中，一种常见的“脱靶”是编辑与靶基因同源的其他拷贝，这在一定程度上是可预测的。提高特异性的方法包括使用高保真Cas变体、优化gRNA设计、采用瞬时表达系统或直接递送核糖核蛋白(RNP)复合体。全基因组测序(WGS)和多种生物信息学工具（如CRISPR-PLANT v2, CCTop）可用于预测和检测脱靶效应。目前，全球尚未就基因编辑作物的脱靶检测建立统一的强制性标准，但学术界和工业界已形成基于风险评估的分层框架。
外源基因残留
通过农杆菌转化引入CRISPR/Cas9构件时，载体片段可能随机插入植物基因组，留下外源基因序列。这可能会破坏内源基因，并且Cas核酸酶的持续表达会增加脱靶风险。为获得无外源DNA的编辑植株，研究人员开发了多种递送方法。瞬时转化策略，即在无抗生素筛选压力下进行农杆菌介导的短时转化，可在部分再生植株中获得无外源DNA的突变体。病毒载体能够系统性递送编辑组件且通常不整合，但运载容量有限。最彻底的方法是直接向原生质体递送预组装的Cas9-sgRNA RNP复合体，通过PEG转化或电击法实现编辑，随后再生植株，该方法完全避免了外源DNA的引入。对于马铃薯等无性繁殖作物，避免外源基因整合是商业化应用的重要前提。
对人类/动物健康的毒性影响
CRISPR/Cas组件本身对植物再生没有显示出固有的毒性。毒性主要可能与递送方法有关。不同的递送工具（农杆菌、基因枪、PEG、病毒载体、纳米材料等）各有优缺点。新型纳米材料，如介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)、碳纳米管(CNT)、层状双氢氧化物(LDH)等，在靶向递送生物大分子方面展现出潜力，且细胞毒性低。关键在于，无论采用何种递送方法，最终商业化应用的基因编辑作物产品本身，需要经过严格的安全性评价，确保其与传统育种作物在食品安全性上无实质差异。
安全性评价体系：各国对CRISPR/Cas技术的不同态度
全球对基因编辑作物的安全评估主要存在两种模式：以产品为导向（关注作物本身特性）和以过程为导向（监管技术研发过程）。
美国、加拿大采取产品导向模式。美国依据《生物技术监管协调框架》，由农业部(USDA)、食品药品管理局(FDA)和环保署(EPA)根据作物性状而非技术过程进行监管。USDA已豁免了多个不含外源基因的基因编辑作物。FDA则通过自愿咨询程序，对基因编辑食品进行安全性评估。加拿大食品检验署(CFIA)也将不包含外源DNA的基因编辑作物视为常规品种管理。
欧盟长期坚持严格的过程监管，将基因编辑作物纳入转基因生物(GMO)法规管理。2023年7月，欧盟委员会提出修订提案，拟对通过定向诱变和顺式诱变获得的NGT植物实施更宽松的监管，但该提案尚在立法进程中。英国则在脱欧后通过了《基因技术（精准育种）法案》，将精准育种产品移出GMO监管框架。
澳大利亚采取了中间路线。基因技术监管办公室(OGTR)规定，不使用外源DNA模板的SDN-1型编辑产品可免于监管，而使用模板的SDN-2和SDN-3型产品则需接受监管。
中国在现有转基因生物安全管理法律框架下，于2022年1月由农业农村部制定了《农业用基因编辑植物安全评价指南（试行）》，对不含外源基因的基因编辑植物，简化了安全评价程序，迈出了区分基因编辑与转基因作物监管的重要一步。
