《Molecules》：Optimization of Extraction Process for Flavonoids from Sonchus oleraceus L. and Evaluation of Anti-Inflammatory Activity of Luteoloside
Ke Sheng,
Junyao You,
Shuai Tian,
Yaling Lu,
Jiamin Wu and
Jianping Zhang
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本研究针对新疆苦苣菜(S. oleraceus)中总黄酮的提取工艺优化及其关键活性成分木犀草苷(luteoloside)的抗炎活性评价问题，采用响应面法(RSM)成功优化了提取条件(乙醇浓度62%，时间30 min，料液比1:91 g/mL，温度64 °C，得率21.64 mg/g)，并利用HPLC测得木犀草苷含量为44.06 μg/g。细胞实验进一步证实，木犀草苷可有效抑制LPS诱导的兔(O. cuniculus)结肠上皮细胞释放TNF-α、IL-6等促炎因子，并促进抗炎因子IL-10的表达，为其作为抗炎天然产物的开发提供了实验依据。
在自然界丰富的植物资源宝库中，苦苣菜(Sonchus oleraceus L.)作为一种全球食药两用的野生草本植物，长久以来因其潜在的抗炎、抗肿瘤等多种生物活性而备受关注。其富含的黄酮类化合物是这些功效的重要物质基础。然而，如何高效、绿色地从植物材料中提取这些活性成分，并阐明其具体功效与机制，是将传统药用植物转化为现代药物或功能食品的关键科学问题。尽管超声辅助提取等技术已被广泛应用，但提取工艺参数的优化直接影响着得率与成本。同时，从复杂的植物提取物中分离鉴定出关键的单体化合物，并验证其在细胞乃至动物模型中的确切活性，是现代天然产物研究的核心挑战。这项发表在《Molecules》杂志上的研究，正是为了应对这些挑战，系统性地探索了来自新疆的苦苣菜资源的价值。
为了系统回答上述问题，研究团队运用了多项关键技术。他们首先采用超声辅助提取法结合响应面法(Response Surface Methodology, RSM)对总黄酮的提取工艺进行优化。获得粗提物后，利用D101大孔树脂和聚酰胺柱色谱进行分离纯化，以富集目标成分木犀草苷。对纯化后的木犀草苷单体，研究采用高效液相色谱法(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)进行定量分析。在活性评价层面，研究建立了脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导的兔(Oryctolagus cuniculus)结肠上皮细胞炎症模型，并运用CCK-8法和酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)来分别检测细胞活力和炎症因子水平。
2.1. 单因素实验结果
研究人员首先通过单因素实验，初步探索了乙醇浓度、提取时间、料液比和提取温度四个因素对总黄酮得率的影响。结果显示，当乙醇浓度为60%、提取时间为30分钟、料液比为1:90 g/mL、提取温度为60°C时，总黄酮得率分别达到峰值（12.96, 17.22, 21.44, 12.94 mg/g）。这些结果为后续的响应面优化实验确定了关键因素的合理水平范围。
2.2. 响应面优化实验结果分析
在单因素实验基础上，研究采用Box-Behnken设计进行响应面优化。通过建立数学模型并进行方差分析，发现模型高度显著，拟合度良好。乙醇浓度、料液比和提取温度对总黄酮得率有极显著的线性影响。响应面图直观地展示了各因素间的交互作用，其中乙醇浓度与提取时间、乙醇浓度与料液比、料液比与提取温度之间的交互作用尤为显著。通过求解回归方程，得到了理论最优工艺参数：乙醇浓度62.36%，提取时间30.15分钟，料液比1:91.05 g/mL，提取温度64.33°C，预测得率为21.64 mg/g。结合实际操作，将条件修正为乙醇浓度62%，提取时间30分钟，料液比1:91 g/mL，提取温度64°C，在此条件下进行三次平行验证实验，平均得率为21.56 mg/g，与预测值非常接近，证实了模型的可靠性。
2.3. 新疆苦苣菜中木犀草苷含量的测定
研究采用聚酰胺柱色谱对总黄酮提取物进行进一步分离纯化，得到了木犀草苷单体。通过高效液相色谱法(HPLC)分析，以木犀草苷标准品为参照，确定了样品中木犀草苷的色谱峰（保留时间约21分钟），并计算出经纯化后，木犀草苷的含量为44.06 μg/g。
2.4. 不同浓度木犀草苷对兔结肠上皮细胞活性的影响
为评估木犀草苷的细胞毒性并确定后续实验的安全浓度，研究使用CCK-8法检测了不同浓度木犀草苷处理24小时后对兔结肠上皮细胞活力的影响。结果显示，在低于50 μmol/L的浓度下，细胞活力与空白对照组相比无显著差异，均保持在95%以上，表明在此范围内木犀草苷无明显细胞毒性。当浓度升至100 μmol/L时，细胞活力显著下降至约80%，表明该浓度下木犀草苷开始表现出轻微的细胞增殖抑制或细胞毒性作用。因此，研究后续选择50 μmol/L和100 μmol/L两个浓度进行抗炎活性评价。
2.5. 木犀草苷对LPS诱导的细胞损伤的保护作用
通过建立LPS诱导的兔结肠上皮细胞炎症损伤模型，研究评估了木犀草苷的保护作用。与正常对照组相比，单独LPS处理导致细胞活力极显著下降，表明模型建立成功。而与LPS模型组相比，用50 μmol/L和100 μmol/L木犀草苷进行预处理，可显著恢复细胞活力，证明木犀草苷能有效逆转LPS诱导的细胞毒性。
2.6. ELISA法测定细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平
为进一步阐明木犀草苷的抗炎机制，研究通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测了细胞上清液中关键炎症因子的水平。结果表明，与正常对照组相比，LPS处理显著提升了促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。而在LPS诱导的基础上，分别添加50 μmol/L和100 μmol/L木犀草苷进行干预，与单独LPS处理组相比，促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达被显著抑制，并呈现一定的剂量依赖性趋势。同时，抗炎因子IL-10的表达则被显著促进。这些结果明确表明，木犀草苷能够有效抑制LPS诱导的促炎细胞因子释放，并促进抗炎细胞因子的表达，从而调节炎症介质的平衡，缓解细胞炎症状态。一个有趣的现象是，尽管100 μmol/L木犀草苷单独处理会降低细胞活力，但在LPS存在的炎症环境下，它却表现出保护作用，恢复了细胞活力。这提示木犀草苷的作用可能具有“环境依赖性”，在病理性的炎症条件下，其强效的抗炎特性占主导地位，从而保护细胞免受损伤。
2.7. 木犀草苷的分离纯化流程
研究详细描述了从苦苣菜总黄酮粗提物中分离纯化得到木犀草苷单体的过程。主要步骤包括利用D101大孔树脂对粗提物进行初步富集，再通过聚酰胺柱色谱，使用不同比例的氯仿-甲醇洗脱液进行梯度洗脱，最终对目标洗脱部分进行浓缩和重结晶，获得纯化的木犀草苷单体。
本研究通过响应面法成功优化了新疆苦苣菜总黄酮的提取工艺，确立了高效、稳定的提取方案，总黄酮得率达到21.56 mg/g。进一步从中分离纯化出关键活性成分木犀草苷，其含量经测定为44.06 μg/g。体外细胞实验的核心结论是，木犀草苷对LPS诱导的兔结肠上皮细胞炎症具有明确的保护作用和抗炎活性。其作用机制在于，它能显著抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，同时促进抗炎细胞因子IL-10的表达，从而调节炎症反应的平衡。这些发现不仅为从苦苣菜中高效获取木犀草苷提供了可行的工艺路径，更重要的是在细胞水平上为其抗炎功效提供了直接证据，深化了对这种天然黄酮苷生物活性的理解。鉴于炎症性疾病在畜牧业中的普遍性，木犀草苷展现出作为天然饲料添加剂或治疗剂，用于改善动物健康、促进可持续畜牧生产的潜在应用前景。当然，其确切的治疗效果和药代动力学特征仍有待后续的动物体内实验进一步验证。
