《Acta Biomaterialia》：Development of a Nanocement Platform for Site-Specific Antibiotic Delivery in Skeletal Tuberculosis
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本研究开发了一种基于纳米羟基磷灰石的骨水泥（Nanocement），可局部递送抗结核药物利福平和异烟肼，促进骨再生。实验显示，Nanocement在动物模型中显著优于口服治疗，减少耐药性和生物膜形成，为骨结核治疗提供了创新策略。
Irfan Qayoom|Purva Gupta|Abhishek Dash|Vimal Kumar|Abdul Mabood Khan|Ashok Kumar
印度理工学院坎普尔分校生物科学与生物工程系，印度北方邦坎普尔208016
摘要
脊柱、髋关节和膝关节的骨关节结核感染是最常见的肺外结核（EPTB）类型，占所有EPTB病例的10-15%。由于骨关节结核感染延误诊断或误诊会导致严重的临床后果，加之当前口服抗生素治疗的局限性，因此迫切需要新的治疗策略。利用先进的仿生生物材料作为载体系统进行局部抗生素递送是一种有效的替代方案。在本研究中，我们开发了一种可注射的、具有生物相容性的纳米羟基磷灰石基载体系统（Nanocement；NC），其成分与天然骨矿物质相似，用于局部递送两种一线抗结核药物——异烟肼和利福平。我们对NC的物理化学性质、体外生物相容性以及抗分枝杆菌活性进行了评估，使用的是毒力强的H37Rv型结核分枝杆菌菌株。最终，将载有抗生素的NC植入豚鼠的脊柱和胫骨结核感染模型中，同时使用口服抗生素作为对照组。结果表明，这种抗生素载体系统具有巨大的潜力，可以作为口服抗生素治疗的替代方案，或者与口服疗法结合使用效果更佳。在手术清创过程中会形成不规则的死腔，需要局部控制感染并促进早期骨骼愈合，而不仅仅是立即恢复结构。作为可注射的骨水泥，NC经过优化，能够适应这些腔体，提供持续的抗结核治疗，并创造有利于骨骼再生的微环境。尽管其固有的机械性能可能限制其在需要结构支持的较大缺损中的应用，但NC可以与固定装置或二次移植策略结合使用。
重要性声明
骨关节结核仍然是一个严重的全球健康问题，诊断延误和系统性抗生素疗效有限常常导致不可逆的骨骼损伤。本研究探索了一种自主研发的可注射纳米羟基磷灰石基“Nanocement”的潜力，该材料能够局部同时递送异烟肼和利福平，并同时起到骨传导填充物的作用。通过直接针对感染性骨病变，这种仿生载体在体内对毒力强的结核分枝杆菌表现出强效且持久的抗分枝杆菌活性，同时促进感染性病变的骨骼愈合。这种双重作用策略为传统口服疗法提供了变革性的替代方案，突显了一种具有临床转化性的方法，可用于治疗复杂的骨感染。
引言
根据世界卫生组织（WHO）2025年全球结核病报告，近年来结核病病例有所增加，2024年估计有1070万人患病，2023年为1080万人，而2022年、2021年和2020年分别为1070万人和1010万人。这标志着2020年之前的长期下降趋势出现了逆转，2023年的结核病发病率回到了2018年的水平。总体而言，2015年至2023年间全球结核病发病率仅减少了8.3%，远低于WHO设定的到2025年减少50%的目标[1]。据估计，肺外结核（EPTB）病例占所有报告病例的约16%，而在所有EPTB病例中，10-15%是由骨和关节结核感染引起的[2]。承重骨骼和脊柱是最常见的骨结核感染部位，这些感染常伴随隐匿性疼痛、神经功能障碍，最终导致骨溶解[3]。目前的临床治疗策略包括手术以及前两个月使用一线抗结核抗生素（异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺）的长期口服治疗，随后继续使用异烟肼和利福平4-6个月[4,5]。然而，由于抗生素在骨病灶处的分布有限，这种口服抗生素方案难以有效根除感染性病变及其相关并发症。口服抗生素往往难以渗透到骨组织和缺血区域，导致感染部位的药物浓度不足。骨感染处的缺氧和酸性环境会降低抗生素的效果[6]。此外，感染部位不规则的抗生素剂量增加了生物膜形成的风险，从而使耐药菌株存活下来[7,8]。虽然静脉注射（IV）给药在严重病例或口服治疗不可行时是一个重要的临床选择，但它并不能完全解决骨关节结核的核心问题。即使通过静脉注射，由于血管化不良、缺氧和酸性微环境以及细菌在坏死骨和肉芽组织中的隔离，也难以在感染骨内达到并维持治疗药物浓度[9, [10], [11]]。局部抗生素治疗通过开发生物相容性和可降解的生物材料载体，克服了口服和静脉注射抗生素的许多局限性。这些生物材料载体能够实现针对感染部位的靶向和持续药物递送，同时解决结核病灶处的缺氧问题。此外，局部抗生素递送可作为手术植入的辅助疗法，降低植入物失败和细菌耐药性产生的风险[12]。基于生物材料和组织工程的局部药物递送方法为克服当前治疗方案的某些局限性提供了新的途径[13], [14], [15]]。这种方法的主要目标是设计和开发具有高效生物相容性和所需抗菌剂释放特性的抗感染生物材料[16]。虽然已经开发出多种不同的生物材料，但每种材料都存在固有的局限性，限制了其临床效果。一些材料基本上是惰性的，无法积极支持组织再生[17]；另一些材料则导致抗生素的不可控释放，从而缩短治疗效果[18]。还有一些材料不可降解，需要二次手术移除[19]或引起不必要的免疫反应[20]。此外，迄今为止开发的任何药物递送材料都未经过针对抗分枝杆菌活性的广泛研究。现有的商业产品（如PerOssal?、Stimulan?、Osteoset? T和Cerament?）要么不含抗生素，要么仅含有庆大霉素等通用抗生素[21], [22], [23]]。这些材料主要用于骨传导性空隙填充和载体，通常装载广谱抗生素以治疗化脓性骨髓炎，而非专门针对结核分枝杆菌[24]。这些材料缺乏纳米结构控制，尚未报道能够持续、局部递送一线抗结核药物（如异烟肼和利福平）。相比之下，我们开发的纳米羟基磷灰石-硫酸钙纳米水泥结合了仿生纳米级nHAP，能够在病灶部位增强骨骼再生并控制结核特异性抗生素的释放，从而实现长期局部药物暴露、改善药物在感染骨中的渗透，并降低全身毒性。因此，与现有商业产品相比，这种纳米水泥为骨结核管理提供了一个独特的、双功能的平台。
纳米羟基磷灰石基磷酸钙因其成分与天然骨矿物质高度相似，在骨组织工程中成为一种变革性材料[24]。在之前的研究中，我们已经证明了基于复合纳米羟基磷灰石的材料在促进大尺寸骨缺损[25]、骨质疏松性骨折[26]和骨髓炎感染性骨病变[27], [28], [29], [30]]中的骨骼再生方面的潜力。我们观察到，双相纳米羟基磷灰石-硫酸钙半水合物复合材料表现出不同的利福平和异烟肼释放模式：利福平以持续方式释放三个月，而异烟肼则呈现爆发性释放[28]。
在本研究中，我们制备了一种双相纳米羟基磷灰石-硫酸钙半水合物骨替代物（Nanocement；NC），其中装载了利福平（RFP）和异烟肼（INH），单独或联合使用，并评估了其抗分枝杆菌效果。在平板培养和生物膜条件下，评估了其对结核分枝杆菌H37Rv的体外活性。通过将H37Rv感染豚鼠的胫骨和胸椎，建立了骨关节结核的体内模型。将载有抗生素的NC局部植入感染部位，而对照组动物则接受两个月的口服DOTS治疗（利福平和异烟肼）。通过细菌存活情况、微计算机断层扫描和骨病变的组织学分析来评估治疗效果。比较了局部治疗组和口服治疗组的骨骼再生和病变愈合情况。为了增强骨骼再生，NC还添加了唑来膦酸和骨形态发生蛋白（BMPs）。唑来膦酸用于抑制破骨细胞介导的吸收，而BMPs促进成骨分化和矿化。这种多功能NC实现了同时控制感染和促进骨骼再生的效果。
材料
硝酸钙四水合物、正磷酸氢二铵和硫酸钙二水合物购自印度SD Fine-Chem公司。Dulbecco最小必需培养基（DMEM）、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）和胰蛋白酶-EDTA购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma公司。胎牛血清（FBS）购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Gibco公司。抗生素混合物（青霉素和链霉素）购自印度Hi-Media公司。利福平和异烟肼购自...
电子显微镜
扫描电子显微镜（SEM）图像显示nHAP具有颗粒状形态特征，表明它形成小的单个颗粒或较小颗粒的聚集体，而不是连续或光滑的表面（图2C）。透射电子显微镜（TEM）成像显示nHAP的颗粒大小在30-50纳米范围内，选择性区域电子衍射（SAED）观察到明显的HAP衍射环（图2C）。此外，α-CSH的SEM图像显示针状形态特征（图2D）
讨论
开放性骨折和假体骨植入物中的骨感染具有毁灭性后果，当前治疗干预措施的疗效有限，这促使人们开发新的技术和手术方法来治疗或预防骨感染及其相关并发症[36], [37], [38], [39]]。观察到，长期暴露于低于最低抑制浓度的抗生素会导致抗生素耐药性
结论与重要性
骨骼结核感染是最常见的肺外结核感染类型之一，但由于数据缺乏和误诊，其报告率仍然较低。印度是全球结核病负担最重的国家[55]，这增加了发生骨骼结核感染的风险。2021年6月，美国疾病控制与预防中心（CDC）报告了脊柱手术中接受捐赠骨移植的患者发生结核感染的暴发[56]。CDC与州和地方卫生部门合作...
作者贡献
IQ和AK在与VK和AMK讨论后设计并构思了这项研究。IQ、AD和PG制作了支架，并进行了所有体外和体内实验。IQ撰写了手稿，AK和其他合作者参与了手稿的修订和编辑。
数据可用性
支持本研究发现的数据可应相应作者的要求提供。
作者贡献声明
Irfan Qayoom：写作——审稿与编辑、撰写初稿、可视化、验证、软件开发、方法学研究、资金获取、数据分析、概念化。Purva Gupta：写作——审稿与编辑、方法学研究、数据分析。Abhishek Dash：写作——审稿与编辑、软件开发、方法学研究。Vimal Kumar：写作——审稿与编辑、方法学研究。Abdul Mabood Khan：写作——审稿与编辑、验证。Ashok Kumar：
