通过酶动力学和微尺度热泳技术发现3-苯基-2H-氮杂环丁烷衍生物可作为SARS-CoV-2主要蛋白酶的强效不可逆抑制剂

《Bioorganic Chemistry》：Discovery of 3-phenyl-2H-aziridine derivatives as potent irreversible inhibitors of SARS-CoV-2 main protease via enzyme kinetics and microscale thermophoresis

本研究采用FRET筛选方法评估了31种3-苯基-2H-氮杂环衍生物对SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）的抑制活性，发现最佳抑制剂3ab（IC50=0.41±0.03 μM）通过共价结合Cys145实现不可逆抑制。

　　

王学渊|张淼|陈乐瑶|于文泉|常晓宇|王瑞勇

郑州大学平远实验室化学学院，中国郑州450001

摘要

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的主要蛋白酶（Mpro）因其对病毒基因组复制的关键作用以及在冠状病毒中的高度保守性而成为理想的药物靶点。本研究采用基于荧光共振能量转移（FRET）的s0063reening方法，评估了31种3-苯基-2H-氮杂环衍生物对Mpro的抑制活性。通过酶抑制试验、酶动力学、荧光猝灭、同步荧光、3D荧光、圆二色光谱、微尺度热泳、分子对接和分子动力学模拟等方法，研究了有效抑制剂的作用机制。结果表明，3-苯基-2H-氮杂环衍生物具有显著的抑制SARS-CoV-2 Mpro的潜力。其中最有效的化合物3ab（甲基3-苯基-2-硒氰基-2H-氮杂环-2-羧酸酯）的IC50值为0.41 ± 0.03 μM，它通过与其关键氨基酸残基Cys145形成共价键而发挥不可逆的抑制作用，解离常数（Kd）为247.37 ± 53.73 nM。这项工作加深了人们对Mpro抑制剂机制的理解，并为Mpro抑制剂的设计提供了新的见解。所鉴定的抑制剂是抗病毒药物发现中的有希望的先导化合物。

引言

众所周知，由2019新型冠状病毒（2019-nCoV）引发的全球COVID-19大流行对全球公共卫生、经济和社会生活产生了重大影响[1][2]。冠状病毒（CoV）属于冠状病毒科，该科分为四个属：α-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒[3]。2019年底出现的新型SARS冠状病毒SARS-CoV-2与2002年爆发的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）以及2012年出现的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）同属β-冠状病毒家族[4]。由于其高致病性、高死亡率、跨物种传播能力、高传染性和基因突变性，β-冠状病毒已成为对全球公共卫生的持续潜在威胁[5][6]。

SARS-CoV-2是一种具有正义单链RNA基因组的β-冠状病毒。普遍认为，SARS-CoV-2基因组包含14个主要开放阅读框（ORFs）[7]。ORF1a和ORF1b编码两种多聚蛋白pp1a和pp1ab。pp1a包含从nsp1到nsp11的序列，而pp1ab包含从nsp1到nsp16的序列[8]。通过自我切割，主要蛋白酶Mpro（nsp5）和类木瓜蛋白酶PLpro（nsp3的一个结构域）从病毒多聚蛋白中释放出来，并进一步切割其他位点以生成功能性非结构蛋白，如依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp，nsp12），后者负责病毒的RNA复制和转录[9][10]。因此，针对Mpro蛋白是抑制SARS-CoV-2感染和复制的合理策略[11]。

SARS-CoV-2 Mpro是一种由306个氨基酸组成的多肽，分子量约为33.8 kDa。SARS-CoV-2 Mpro以同二聚体的形式存在，这与大多数已知冠状病毒的组成一致[12]。每个单体由三个结构域（Domain I-III）组成。SARS-CoV-2 Mpro的催化中心位于Domain I和Domain II之间，由一个催化二聚体（Cys145-His41）构成，其中Cys145是亲核试剂，His41起碱基作用[13]。Mpro的活性位点包含四个关键的底物结合位点（S1′、S1、S2和S4；图1），这些位点共同构成了Mpro的底物结合口袋[14]。Mpro在冠状病毒中高度保守，针对Mpro设计的抑制剂可能对多种冠状病毒有效[15][16]。例如，基于SARS-CoV Mpro抑制剂的研究，辉瑞公司优化了化合物PF-07321332（Nirmatrelvir）的设计，该化合物在抑制SARS-CoV-2 Mpro方面非常有效，并已获批准上市[17]。Mpro不仅在冠状病毒中高度保守，而且在其他病毒家族（如小RNA病毒科）中也具有类似的功能。针对Mpro的药物可能具有广谱抗病毒效果。例如，临床批准的抗HCV药物Boceprevir通过靶向Mpro有效抑制SARS-CoV-2[18][19]。Mpro在人类细胞中没有同源物，因此针对Mpro的药物通常具有较低的宿主毒性[20]。Mpro的底物结合口袋（S1′、S1、S2和S4位点）可以容纳具有多种化学结构的抑制剂，为药物设计提供了灵活性[21][22]。Paxlovid针对SARS-CoV-2 Mpro的效果以及在日本获批的Ensitrelvir（S-217622）证明了Mpro作为靶点的可行性[23]。总之，Mpro是一个极具前景的抗病毒药物靶点。

目前，针对SARS-CoV-2 Mpro的药物研发旨在抑制其活性，从而阻止多聚蛋白生成非结构蛋白，最终抑制SARS-CoV-2的复制[24]。辉瑞公司开发的肽模拟共价药物Paxlovid是由Mpro抑制剂Nirmatrelvir和低剂量药代动力学增强剂Ritonavir组成的组合[25]。Mpro Cys145上的巯基（-SH）被His41去质子化形成硫醇盐（-S?）。该亲核试剂攻击Nirmatrelvir上的腈基（-CN），形成硫醇-亚胺中间体，随后该中间体重新排列形成稳定的共价键。共价结合后，Mpro的催化活性被抑制[26][27][28][29]。关键抑制剂的IC50值分别为：Boceprevir（8.0 ± 1.5 μM）、GC376（0.15 ± 0.03 μM）、Ebselen（0.67 ± 0.09 μM）、Ensitrelvir（0.049 ± 0.001 μM）和Nirmatrelvir（0.044 ± 0.001 μM）[18][20][30]。这些抑制剂的化学结构见图2。

2H-氮杂环是最小的含有氮原子的不饱和杂环，它结合了三元环固有的高应变性和足够的化学修饰稳定性。它代表了一个具有潜在生物活性的含氮杂环系统[31]。此外，基于2H-氮杂环的化合物也可用于生物偶联[32]。含有羧基取代的2H-氮杂环结构的天然产物表现出广谱抗菌活性。Sakharov等人设计并合成了3-芳基-2H-氮杂环-2-羧酸衍生物，这些衍生物在-20°C长期储存下仍保持稳定。这些化合物对ESKAPE病原体表现出与磺胺甲噁唑相当的抗菌活性，同时具有较低的细胞毒性[33]。Lin等人设计了二芳基取代的2H-氮杂环衍生物，这些衍生物通过同时靶向微管蛋白和DNA发挥双重抗肿瘤作用[34]。Maia等人合成了2H-氮杂环-2-氮杂环酮化合物，能够在HL-60细胞系中诱导细胞凋亡，为抗癌药物开发提供了新的思路[35]。Motualevic酸F是自然界中发现的第一种长链2H-氮杂环-2-羧酸，其在1.2至10.9 μg/mL的浓度范围内抑制了金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的生长[36]。He等人报告称，将2H-氮杂环结构引入EGFRL858R/T790M/C797S抑制剂中可显著降解目标蛋白[37]。尽管关于2H-氮杂环衍生物抗病毒活性的报道有限，但我们的实验室发现了一系列具有这种骨架的化合物，在酶学实验中对SARS-CoV-2 Mpro表现出强烈的抑制活性。我们在本工作中评估了它们的抑制效果并阐明了其详细的作用机制。

材料

制备了25 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），其中含有150 mM NaCl，通过0.22 μm膜过滤后储存在4°C。根据已发表的方案[20]表达并纯化了Mpro蛋白。所得蛋白储备液（4.85 mg/mL）在液氮中快速冷冻后储存在-80°C。使用Tris-HCl缓冲液将蛋白稀释至所需浓度。为保持蛋白活性，每次实验前均新鲜稀释Mpro并解冻。

高通量筛选方法

FRET（F?rster共振能量转移）是一种非辐射能量转移过程。当荧光供体（Edans）和淬灭剂（Dabcyl）之间的距离在1–10 nm范围内时，Edans发出的荧光被Dabcyl吸收。当底物（KTSAVLQSGFRKME）被Mpro切割时，Edans与Dabcyl分离。Edans（EXmax = 340 nm，EMmax = 490 nm）在激发光下被激发并发出荧光[44]。这种荧光强度定量反映了Mpro的活性。

结论

新型Mpro抑制剂不仅可以有效治疗COVID-19，还可以应对未来由冠状病毒突变带来的挑战。通过多种实验方法，我们确认3-苯基-2H-氮杂环衍生物是有效的Mpro抑制剂。它们的抑制效力（通过IC50值确定）依次为：3ab 3w ≈ 3x ≈ 3u′ 3l 3aa 3s 3j ≈ 3ac ≈ 3z 3u 3ad 3o ≈ 3m ≈ 3k ≈ 3v。其中，化合物3ab的IC50值为0.41 ± 0.03 μM。

作者贡献

X. W.、L.C.和M.Z.进行了研究。X. C.准备了蛋白。R. W.设计了研究方案。W. Y.合成了衍生物。X. W.和R. W.撰写了论文。所有作者都审阅了手稿。

作者贡献声明

王学渊：撰写 – 原始草稿，实验研究。张淼：实验研究。陈乐瑶：实验研究。于文泉：资源提供。常晓宇：资源提供。王瑞勇：撰写 – 审稿与编辑，监督。

资助

作者感谢国家自然科学基金（编号：82130103）的财政支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。