《Biosensors and Bioelectronics》：A Proximity Induced Strand Displacement Amplification and CRISPR/Cas12a-Based SERS Assay for Ultrasensitive Detection of Dengue Virus
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基于表面增强拉曼散射（SERS）与CRISPR/Cas12a联用的高灵敏度登革病毒1型（DENV-1）检测新方法，通过单链位移扩增（SDA）与核酸酶切效应实现信号反转，检测限达4.68 fM，并具备优异的病原体特异性及模块化适配潜力。
张嘉胤|张卫鹏|严杰宇|张一瑞|郑杰|刘一依|顾宁|韩坤
南京师范大学食品科学与制药工程学院，中国南京210023
摘要
登革热病毒（DENV）是一种通过蚊子传播的单链RNA病毒，可引发登革热，并可能发展成严重疾病，对公共卫生构成重大威胁。快速且高灵敏度的检测对于早期诊断DENV至关重要。然而，DENV与其他病毒感染（如基孔肯雅病毒或寨卡病毒）的症状相似，难以区分，同时现有检测方法特异性不足且耗时较长。本文介绍了一种表面增强拉曼散射（SERS）生物传感器，该传感器结合了链置换扩增（SDA）和CRISPR/Cas12a技术，实现了对DENV的超灵敏检测。在没有DENV的情况下，SDA和Cas12a处于非活性状态，SERS探针由于单链连接子的交联而保持聚集状态，显示出强烈的SERS信号。当目标序列存在时，SDA生成大量的单链触发子，通过crRNA识别激活Cas12a，切割连接子以解除交联，使SERS探针处于分散状态，从而显示出较弱的SERS信号。该方法对登革热病毒1型（DENV-1）具有极高的灵敏度，检测限低至4.68 fM。此外，该方法还能准确区分DENV-1与其他病原体，保持可靠的性能。该策略的模块化设计使其能够适应不同的检测目标，不仅是一种用于高灵敏度诊断DENV-1的有前景的工具，也是一个用于精确识别其他病原体的多功能平台。
引言
登革热由单链RNA病毒DENV（属于黄病毒科Flavivirus属）引起，是全球范围内传播最快的蚊媒疾病之一（Weaver和Vasilakis，2009年）。感染主要通过雌性伊蚊传播，临床表现从自限性发热到登革出血热和登革休克综合征等严重后果不等（Bhatt等人，2013年；Idrees和Ashfaq，2012年；Roy和Bhattacharjee，2021年）。值得注意的是，大部分初次感染患者无症状或仅有类似流感的症状，这削弱了综合征的监测能力，导致诊断负担转移到病毒血症较低的早期阶段，而此时公共卫生干预措施最为有效（Gubler，1998年）。
目前针对登革热的实验室检测方法——非结构蛋白1（NS1）抗原检测、血清学检测、病毒培养和核酸扩增——都存在局限性，限制了其广泛应用（Diamond等人，2000年；Jaiswal等人，2015年）。例如，NS1检测方法快速且成本低廉，但通常难以区分不同血清型（Lai等人，2019年）；病毒培养虽然具有确诊价值，但过程繁琐且需要生物安全设施（Muller等人，2017年）；而RT-PCR虽然具有高灵敏度和特异性，但需要复杂的加热循环仪、训练有素的操作人员以及严格的污染控制（Sekaran和Soe，2017年）。这些限制凸显了亟需一种快速、无需复杂仪器且仍能保持高分析性能的方法。
拉曼光谱是一种非破坏性分析技术，通过检测光的不弹性散射产生的特征分子“指纹”来识别组织的化学组成（Cao等人，2022年；Huang等人，2022年）。表面增强拉曼散射（SERS）在保留拉曼光谱核心优势的同时，将信号强度提高了10^10至10^14倍，因此非常适合临床诊断，因为它结合了单分子级别的灵敏度和狭窄的光谱特征，实现了生物标志物的超灵敏检测（Wang等人，2017年；Zong等人，2018年）。然而，直接使用SERS检测病毒核酸仍存在挑战：早期感染时目标序列较少，生物基质可能抑制热点形成或引入非特异性聚集。解决这些问题需要（i）生物化学预扩增以增强目标信号；（ii）将分子识别转化为稳定的、低背景噪声的光谱变化。
规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统是细菌和古菌中的适应性免疫防御机制，可抵抗噬菌体、病毒和质粒等外来物质的入侵（Barrangou等人，2007年；Chen等人，2018年；Doudna和Charpentier，2014年）。其中，CRISPR/Cas12a通过CRISPR RNA（crRNA）与目标杂交以及特定激活后的单链DNA切割来实现可编程的目标识别（Chen等人，2018年；Darwish等人，2018年；Gootenberg等人，2017年；Tang等人，2021年）。利用这一特性，目标序列的存在可转化为工程报告基因链的选择性切割，从而提高特异性并减少假阳性结果。CRISPR/Cas系统，特别是CRISPR/Cas12a，因其灵敏度、特异性、高碱基对分辨率和核酸识别能力而被重新用于分子诊断，推动了生物传感技术的新发展（Yin等人，2021年）。作为强大诊断工具的核心，它正在改变病毒检测的方式。CRISPR/Cas系统可以与侧向流动条检测、电化学传感器和SERS传感器等生物传感器结合，实现即时诊断（Dai等人，2020年）。链置换扩增（SDA）是一种等温扩增技术（Huang等人，2015年；Xu等人，2015年），通过切割/延伸/链置换循环快速生成大量单链产物，仅需简单的温度控制（Walker等人，1996年；Walker等人，1994年）。将SDA生成的“触发子”与Cas12a切割结合，可形成协同效应：SDA增加目标序列的拷贝数，而Cas12a提供序列编程的特异性和下游信号传递的便捷酶促机制。
本文报道了一种基于SERS的生物传感器，该传感器结合了SDA和CRISPR/Cas12a介导的短链ssDNA连接子（称为Linker）切割，用于快速检测DENV-1核酸（最常见的DENV血清型）。目标序列诱导形成三向连接结构（TWJ），启动SDA生成单链触发子，触发子随后激活Cas12a切割Linker。Linker专门设计用于促进两种拉曼探针SH-DNA1和SH-DNA2（分别与4-巯基苯甲酸（4-MBA）修饰的金纳米粒子（AuNPs@4-MBA@SH-DNA1和AuNPs@4-MBA@SH-DNA2，分别称为Probe1和Probe2）的邻近组装。目标序列的存在阻止了探针之间的聚集，导致热点密度显著降低和特征拉曼带强度减弱。相反，在没有DENV-1的情况下，Linker保持完整，探针能够正常组装，从而产生强烈的SERS信号。
基于SDA-CRISPR/Cas12a的SERS生物传感器检测DENV-1的原理
该SERS生物传感器的原理基于目标触发级联反应，将序列识别转化为拉曼强度的定量降低，如图1所示。在目标序列存在的情况下，碱基配对使其与P1和P2序列紧密相邻。随后Klenow片段聚合酶进行延伸，形成TWJ结构（Liao等人，2021年）。在Klenow片段的作用下，链持续延伸；在Nt.BbvCI酶的作用下，发生...
结论
总结来说，我们成功构建了一种等温、无信号输出的SERS生物传感器，通过结合链置换扩增和CRISPR/Cas12a实现了对DENV-1的检测。DENV-1序列的存在和积累会导致SDA过程的启动，生成触发子，随后CRISPR/Cas12a的切割作用降解Linker，防止Probe1和Probe2之间的交联。
作者贡献声明
张嘉胤：撰写——初稿、验证、方法学设计、实验研究、数据分析。郑杰：撰写——审稿与编辑、资源协调、实验研究。张一瑞：资源协调、实验研究。严杰宇：资源协调、实验研究。张卫鹏：资源协调、数据分析、数据管理。韩坤：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金申请、概念构思。顾宁：撰写——审稿与编辑、资源协调、实验研究。刘一依：撰写——审稿与编辑，
资助
本研究得到了中国国家重点研发计划[2024YFC3406400]、中国科学院战略优先研究计划以及江苏省“333高层次人才培训计划”的支持。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响研究结果客观性或公正性的财务利益冲突或其他关系。所有作者均知晓并同意此声明。
