基于微滴式数字PCR技术多重精准检测鉴定三种常见检疫性粉蚧

摘要： 【目的】应用微滴式数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技术，建立大洋臀纹粉蚧Planococcus minor、南洋臀纹粉蚧Pl. lilacinus和木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus 3种高频截获检疫性粉蚧多重精准检测方法。【方法】以口岸截获和国内采集的常见粉蚧大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧、木瓜秀粉蚧、新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes、杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcus jackbeardsleyi、木槿曼粉蚧Maconellicoccus hirsutus、康氏粉蚧Ps. comstocki和桔臀纹粉蚧Pl. citri为参试材料，选择COⅠ基因序列为靶标，使用GenBank 数据库、 MEGA11和Beacon Designer 8等进行同源性比对和特异性引物与探针设计;在构建的大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧和木瓜秀粉蚧 3种粉蚧单重ddPCR检测体系的基础上，通过筛选最佳引物和探针浓度优化反应体系，建立可同时快速、绝对定量检测大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧和木瓜秀粉蚧基因组拷贝数的多重ddPCR检测方法，并与TaqMan qPCR方法进行比较，测定该方法的灵敏度、定量限及准确性。【结果】构建的多重ddPCR检测体系内各组引物和探针对目标粉蚧基因组均能扩增，未出现交叉反应， DNA最低检测浓度与TaqMan qPCR中的一致。这一多重ddPCR体系对大洋臀纹粉蚧基因组的绝对定量检测低限为0.44拷贝/μL，对南洋臀纹粉蚧基因组的绝对定量检测低限为0.43拷贝/μL，对木瓜秀粉蚧基因组的绝对定量检测低限为0.44拷贝/μL。在定量检测范围内这一多重ddPCR体系定量检测的线性决定系数R²均大于0.99，且重复性和线性相关性较好。【结论】本研究建立的多重ddPCR检测方法可实现对3种高频截获检疫性粉蚧大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧和木瓜秀粉蚧快速、精准鉴定，为口岸外来有害生物防控和保护我国生态安全提供技术服务和支持。