《Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants》：Dual-stage flash–ultrasonic extraction enhances anthraquinone yield and multifunctional bioactivities in
Damnacanthus major cell cultures
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双阶段闪蒸-超声协同提取优化从D. major细胞培养物中蒽醌类化合物提取，响应面法确定乙醇浓度85%、闪蒸时间58秒、超声温度38℃为最佳条件，得率达13.62%。较单阶段方法显著提高效率并减少溶剂使用，提取物具有强α-葡萄糖苷酶抑制活性（>100%）、促进乳酸菌生长及抗炎效果。
作者：Shuo Yu, Zhong-Yu Zhou, Yu-Qing Guo, Yue-Jun Hao, Mei-Yu Jin, Mei-Lan Lian
教育部长白山天然药物重点实验室，延边大学，中国吉林省延吉市公园路977号，133002
摘要
Damnacanthus major是一种富含蒽醌和其他生物活性代谢物的药用植物，具有多种药理活性；然而，传统的提取方法通常效率低下且重复性差。本研究优化了一种双阶段闪蒸-超声协同提取（FE–UE）工艺，以提高从D. major细胞培养物中提取蒽醌的效率，并系统评估了优化提取物的功能特性。通过Plackett–Burman设计（PBD）结合Box–Behnken设计-响应面方法（BBD-RSM），确定了乙醇浓度、闪蒸时间和超声温度为关键参数。最佳条件为：液料比为50 mL/g，乙醇浓度为85%，闪蒸时间为58秒，超声提取时间为60分钟，温度为38°C，功率为50瓦，此时蒽醌的最大含量达到了13.62%。该模型表现出优异的预测能力（R2 = 0.9652，p < 0.001），验证实验也证实了其稳健性。与单阶段方法相比，FE–UE显著提高了提取效率（p < 0.05），同时减少了溶剂使用量和处理时间。
优化后的提取物表现出多种功能活性，包括强剂量依赖性的α-葡萄糖苷酶抑制作用（在2.5 mg/mL浓度下抑制率超过100%）、促进Lactobacillus生长（p < 0.05），以及通过恢复结肠长度和抑制促炎细胞因子来显著保护小鼠免受硫酸葡聚糖钠引起的结肠炎。这些发现表明FE–UE是一种高效、节能且环境友好的方法，适用于从植物细胞培养物中提取蒽醌，并凸显了D. major提取物的广泛营养保健和药用潜力。
引言
Damnacanthus major Siebold & Zuccarini是一种常绿灌木，主要分布于日本，也在中国南部、韩国及邻近地区有少量分布（Lee等人，2024年）。该植物含有丰富的生物活性代谢物，尤其是蒽醌和酚类化合物，具有抗氧化、抗炎和调节代谢等多种药理活性（Hyeon等人，2024年）。由于这些特性，D. major作为开发功能性食品、营养保健品和治疗产品的潜在来源受到了越来越多的关注。然而，这些代谢物在野外生长植物中的自然积累程度受环境条件和季节变化的影响较大，导致产量和质量不稳定（Bapat等人，2023年）。为克服这些挑战，植物细胞培养技术作为一种可持续且可控的系统被用于连续生产高价值的次级代谢物。先前的研究表明，培养的D. major细胞是稳定的、可扩展的蒽醌生物技术来源，为提取和生物活性评估提供了可靠的平台（Hyeon等人，2024年；Lee等人，2024年）。在此背景下，提高代谢物提取效率成为最大化细胞培养资源潜力的关键。
传统的提取方法（如热水提取）通常耗时较长、能耗较高，并且容易使热不稳定化合物发生热降解（Ye等人，2025年）。为了提高产量、纯度和可持续性，人们开发了一系列创新提取技术，包括超声提取（UE）、闪蒸提取（FE）和微波辅助提取（Hao等人，2023年；Melifoglu，2025年；Niu等人，2025年；Qin和Xi，2021年；Zhang等人，2024a）。其中，超声提取因其声空化效应而受到特别关注：气泡破裂会产生局部剪切力、微射流和湍流，从而破坏细胞壁并改善溶剂渗透（Vo等人，2025年）。近年来，超声提取与其他新兴提取技术（如FE、深共晶溶剂提取和酶辅助提取）结合使用，进一步提升了提取效果（Shen等人，2023年）。
当闪蒸提取与超声提取（FE–UE）顺序结合时，会产生互补机制：FE在强烈的剪切应力下促进细胞内物质的快速溶解，而超声提取则有助于通过破坏的细胞基质实现后续的扩散（Fang等人，2025年）。这种双阶段协同提取工艺提高了传质效率，减少了溶剂消耗，并缩短了处理时间，使FE–UE成为一种高效且环保的植物代谢物提取方法。多项研究表明，FE–UE系统在Phyllanthus emblica和Lyophyllum decastes等物种中表现出优异的提取效率（Fang等人，2025年；Yang等人，2025年），但其在植物细胞培养系统中的应用仍需进一步探索。
除了提取优化外，对所得提取物的功能验证对于确认其生物学相关性和应用潜力至关重要。对于新研究的药用植物，系统的生物活性评估不仅能够证实其药理价值，还有助于促进资源的可持续利用和产业化转化（Atanasov等人，2015年）。已有报道指出D. major细胞培养物提取物具有抗氧化和酪氨酸酶抑制作用（Lee等人，2024年），但其更广泛的生物学作用，尤其是在代谢调节、益生菌调节和抗炎方面的作用，仍需进一步研究。
因此，本研究旨在利用Plackett–Burman设计（PBD）和Box–Behnken响应面方法（BBD-RSM）优化从D. major细胞培养物中提取蒽醌的工艺，并全面评估优化提取物的生物活性，包括α-葡萄糖苷酶抑制作用、促进益生菌生长和抗炎效果（在小鼠模型中验证）。本研究提出了一种结合闪蒸提取和超声空化的双阶段协同提取方法，为从植物细胞培养物中高效回收生物活性代谢物提供了新的方法论进展，同时也凸显了D. major提取物的营养保健和药用潜力。
植物材料
用于体外实验的D. major细胞由韩国忠北国立大学的Paek Kee-Yoeup教授提供。细胞培养在改良的Murashige–Skoog（MS）培养基（Murashige和Skoog，1962年）中进行，培养基中含有90 mM氮、1.25 mM磷和3.0 mM钙，外加3 mg/L萘乙酸、0.1 mg/L激动素和30 g/L蔗糖。亚培养物在5 L的气升式生物反应器中生长，培养基体积为4 L，同时进行连续通气（100 mL/min），培养条件为黑暗环境。
单因素分析
通过单因素实验系统评估了六个操作变量对蒽醌产量的影响（图1）。液料比呈现抛物线趋势，最佳产量为40 mL/g；低于或高于此比例时，提取效率均降低（图1A）。液料比过低时，溶剂与细胞基质的接触不足，影响剪切效果；反之，溶剂过量会导致细胞溶解。
结论
本研究建立了一种双阶段闪蒸-超声协同提取工艺，用于高效提取
D. major细胞培养物中的蒽醌。通过PBD和BBD-RSM方法确定了关键工艺参数——乙醇浓度、闪蒸时间和超声温度，并对其进行了优化。回归模型显示出优异的预测准确性（
R2 = 0.9652，
p < 0.001）和重复性（RSD = 0.76%）。
FE–UE工艺显著提高了提取效率。
未引用参考文献
(Student等人，(1992))
CRediT作者贡献声明
Mei-Lan Lian：撰写、审稿与编辑、监督、方法学设计。
Yue-Jun Hao：概念构思。
Yu-Qing Guo：实验研究。
Mei-Yu Jin：数据整理。
Zhong-Yu Zhou：方法学设计。
Shuo Yu：初稿撰写、方法学设计。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（81960685）和吉林省科技发展计划项目（20250206024ZP）的支持。
