《Advanced Healthcare Materials》：CORE: Cholesterol Altered Lipid Nanoparticles for Splenic Expression of mRNA Payloads
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为解决脂质纳米颗粒（LNPs）系统给药后主要靶向肝脏、难以实现肝外递送的挑战，研究人员开发了一系列新型杂环胆固醇衍生物，并基于此构建了CORE LNPs。体内研究表明，CORE LNPs具有良好的耐受性，并能实现静脉注射后mRNA在脾脏的高度选择性表达。该研究为开发用于疫苗和免疫调节的脾脏特异性mRNA疗法提供了新策略。
信使RNA（mRNA）疗法因其能够以可控、细胞特异性的方式瞬时表达蛋白质，已成为治疗多种疾病的潜力策略。然而，mRNA本身易被核糖核酸酶（RNase）降解、分子量大且带负电荷，使其体内递送效率低下。脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）是目前mRNA体内递送的成功策略之一，但一个核心挑战在于，静脉注射后，大多数基于脂质的制剂会促进mRNA在肝脏的递送和表达，难以实现有效的肝外递送。脾脏作为全身免疫激活的核心器官，其中密集的抗原呈递细胞和直接接触血源性病原体的特性，使其成为mRNA疫苗和免疫疗法的理想靶点。那么，能否设计一种新型载体，将治疗性mRNA精准“运送”到脾脏，而非肝脏呢？
为了应对这一递送挑战，研究人员将目光投向了LNPs的经典组分之一——胆固醇。已有研究表明，载脂蛋白E（ApoE）参与血液中胆固醇向肝脏的运输，这可能是LNPs具有肝脏趋向性的原因之一。因此，研究团队提出假设：通过对胆固醇进行结构修饰，或许可以影响这种胆固醇依赖性运输，从而将mRNA的递送和表达转向脾脏。基于此，他们开发了一类新型LNPs，并将其命名为ChOlesterol alteREd lipid nanoparticles (CORE LNPs)。这项研究发表在了《Advanced Healthcare Materials》期刊上。
为了开展这项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们通过化学合成与计算表征相结合，设计并合成了六种新型的含氮杂环胆固醇衍生物（C1-C6），并利用主成分分析（PCA）等计算工具对其23种理化性质进行了表征。其次，他们采用实验设计（Design of Experiment, DoE）方法，系统性地优化了包含新型胆固醇衍生物、可离子化脂质（SM-102）、磷脂（DSPC或DOPE）和PEG化脂质（14:0 PEG 1K）的LNP组分配方，生成了78种不同的CORE LNP制剂，并评估了其粒径、电位、mRNA包封率等物理性质。接着，研究利用树突状细胞（DC 2.4细胞）模型，在体外系统评估了优选CORE LNPs的细胞摄取、摄取机制（使用特异性抑制剂阻断网格蛋白介导的内存作用、巨胞饮作用、小窝蛋白介导的内存作用及吞噬作用）以及内体逃逸能力（通过共聚焦显微镜结合皮尔逊相关系数PCC分析，以及钙黄绿素泄漏实验联合V-ATPase抑制剂巴弗洛霉素A1进行验证）。最后，研究在C57BL/6小鼠体内验证了优选CORE LNPs的mRNA生物分布、脾脏免疫细胞摄取情况以及安全性（通过全血细胞计数、肝肾功能指标检测和组织学分析进行评估）。
结果
杂环胆固醇衍生物的合成与计算表征：研究人员首先合成了六种含氮杂环（氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、3-甲基哌啶、3-乙基哌啶和吗啉）胆固醇衍生物（C1-C6）。计算表征（如主成分分析PCA）显示，C1-C6彼此结构相似，但与天然胆固醇在疏水-亲水轴向上分离，胆固醇更偏向疏水特性，而C1-C6衍生物则表现出不同的极性特征。
CORE LNPs的配方筛选与体外性能评估：通过实验设计优化，研究人员从78种CORE LNP配方中筛选出13种基础配方（FX），并进一步确定了F13为所有六种胆固醇衍生物中性能最优的配方。所有CORE LNPs均能成功形成纳米颗粒，粒径在190-400 nm之间，电位在-10至+5 mV之间，mRNA包封率为20%-85%。体外实验（在DC 2.4细胞中进行）表明，含有C1衍生物的CORE LNPs（CORE C1）平均荧光素酶（FLuc）表达最高，并且C1:F13配方在2小时和24小时的细胞摄取率也最高。研究还发现，随着胆固醇衍生物头部基团环尺寸的增大（如从C1到C3），细胞摄取和mRNA表达有下降趋势。
CORE LNPs的细胞摄取机制：通过使用特异性通路抑制剂，研究人员阐明了CORE LNPs的主要细胞摄取机制。研究发现，所有六种CORE LNPs的摄取主要受到非律平（小窝蛋白介导的内存作用抑制剂）和细胞松弛素D（吞噬作用抑制剂）的抑制，表明小窝蛋白介导的内存作用和吞噬作用是CORE LNPs进入树突状细胞的主要途径。这与作为对照的、使用天然胆固醇的SM-102 LNP（其摄取主要受细胞松弛素D抑制）有所不同，提示胆固醇的修饰改变了细胞对纳米颗粒的识别方式。
CORE LNPs的内体逃逸：内体逃逸是mRNA有效递送的关键限速步骤。通过共聚焦显微镜结合PCC分析，研究人员发现六种CORE LNPs之间内体逃逸效率（以mRNA与内体的共定位程度衡量）无显著差异，但均显著低于SM-102 LNP。进一步的钙黄绿素泄漏实验和巴弗洛霉素A1抑制实验表明，CORE LNPs的内体逃逸依赖于V-ATPase（液泡型ATP酶）和质子海绵效应，因为用巴弗洛霉素A1抑制V-ATPase后，所有CORE LNPs的绿色荧光蛋白（GFP）表达均显著下降。
CORE LNPs的体内生物分布、细胞摄取与安全性验证：在C57BL/6小鼠模型中的体内实验是本研究的关键验证。静脉注射后24小时，活体成像系统（IVIS）显示，所有六种优选CORE LNPs（基于F13配方）均实现了高度选择性的脾脏mRNA表达，脾脏表达占比超过95%。相比之下，SM-102 LNP则有74%的表达分布在肝脏，仅14%在脾脏。在脾脏内，C2:F13配方的表达量最高。进一步的脾脏免疫细胞流式分析表明，C2:F13能被脾脏中的树突状细胞和T细胞高效摄取，且对树突状细胞有摄取偏好。安全性评估显示，所有CORE LNPs处理组小鼠体重下降均小于5%，血液生化指标（如ALT、AST、ALP、肌酐、尿素氮）与裸mRNA或SM-102 LNP对照组相比无显著升高（除C2:F13和C5:F13的AST略有升高，但与SM-102 LNP无差异），且对最高效的C2:F13进行的肝脏、肺和脾脏组织学分析也未发现明显损伤，表明CORE LNPs平台具有良好的耐受性。
结论与讨论
本项研究成功开发了一种名为CORE LNPs的新型mRNA递送平台。该平台的核心创新在于通过化学合成在胆固醇分子上引入含氮杂环头部基团，从而改变了传统LNPs的体内分布命运。研究系统地展示了从新型材料（C1-C6）的设计合成、计算表征，到纳米制剂（CORE LNPs）的配方优化、体外机制探索（细胞摄取、内体逃逸），再到体内功效与安全性验证的完整研发流程。
研究得出的核心结论是：对胆固醇进行特定的杂环修饰，可以有效地将静脉注射后mRNA-LNPs的体内表达从肝脏“重编程”至脾脏，实现超过95%的脾脏特异性表达，且该平台安全耐受。机制上，这种修饰改变了纳米颗粒被树突状细胞识别的途径（更依赖于小窝蛋白介导的内存作用和吞噬作用），并影响了其内体逃逸特性。虽然不同杂环头部基团（C1-C6）在体外细胞摄取和表达效率上存在差异，但在体内均能导向脾脏，表明胆固醇修饰是决定器官趋向性的关键，而具体的头部化学结构可能更精细地调节细胞水平的相互作用和最终表达强度。
这项研究的意义重大。它为解决mRNA-LNPs肝外递送，特别是靶向脾脏这一重要免疫器官的长期挑战，提供了一种基于合理材料设计的新策略。通过聚焦于胆固醇这一LNPs的基本骨架成分进行工程化改造，研究人员不仅开发出了一个高效的脾脏靶向平台，也深化了对胆固醇化学结构如何影响纳米颗粒生物学行为（包括细胞互作、胞内运输和体内分布）的理解。这项工作为开发下一代用于传染病疫苗、癌症免疫疗法及其他需要激活系统性免疫反应的mRNA疗法奠定了重要的技术和材料基础，展示了合成化学与计算表征相结合在先进纳米医药载体设计中的强大潜力。未来，该平台可与编码不同抗原或免疫调节因子的mRNA联用，并在更多疾病模型中验证其治疗功效，具有广阔的临床转化前景。
