通过诱饵效应增强脂质纳米颗粒的渗出，实现去甲基胞嘧啶（decitabine）和siTNF-α的靶向共同递送至白血病治疗中的骨髓微环境

《Journal of Controlled Release》：Baiting-enhanced extravasation of lipid nanoparticles for targeted co-delivery of decitabine and siTNF-α to the bone marrow niche in leukemia therapy

急性髓性白血病（AML）治疗面临药物生物利用度低和骨髓微环境耐药问题。本研究创新性设计并合成了一种基于“诱饵与侧渗”策略的靶向脂质纳米颗粒（BIS-LNPs@DCA-siTNF），通过CXCR4模拟肽和CLL-1靶向配体实现骨髓微环境精准递送，协同去氧核苷酸类似物Decitabine与TNF-α siRNA抑制白血病细胞代谢并增强免疫应答，同时改善骨损伤。实验证明其在动物模型中显著降低白血病负荷并修复骨结构，为AML治疗提供新范式。

朱颖|李秋实|周勇|吴迪|秦环宇|戴金玉|刘一夫|杨磊|辛晓飞|尹立芳

中国药科大学药学院，南京210009，中国

摘要

急性髓系白血病（AML）仍是一种致命的恶性肿瘤，由于药物在骨髓保护性微环境中的生物利用度有限以及治疗抵抗性，其预后较差。本文介绍了一种针对骨髓的脂质纳米颗粒，采用“诱饵和渗出”策略，共同递送缺氧/活性氧（ROS）响应性的地西他滨前体药物和TNF-α siRNA（BIS-LNPs@DCA-siTNF）。BIS-LNPs@DCA-siTNF经过工程改造，含有可被缺氧条件激活的CXCR4模拟肽，以实现CXCL12引导的趋化作用，并配备CLL-1靶向配体，以选择性摄取白血病细胞并破坏紧密连接。优化后的脂质体包裹结构具有高siRNA负载量、良好的胶体稳定性，并能在缺氧和ROS丰富的环境中响应性释放药物，有效模拟AML的微环境。机制上，TNF-α的沉默与地西他滨诱导的细胞毒性协同作用，破坏白血病细胞与脂肪细胞的代谢相互作用，抑制脂肪酸代谢，促进细胞凋亡和细胞周期停滞。在原位AML模型中，BIS-LNPs@DCA-siTNF优先积聚在骨髓中，显著减轻白血病负担，并重新编程微环境以引发抗白血病免疫反应，从而增强CD8⁺ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞在骨髓中的浸润。此外，BIS-LNPs@DCA-siTNF还能抑制破骨细胞生成，恢复骨骼完整性，并改善运动功能。这些结果表明BIS-LNPs@DCA-siTNF是一种可编程纳米平台，能够克服药物学和微环境的障碍，为AML治疗提供了有前景的方法。

引言

急性髓系白血病（AML）是一种高度异质性的恶性肿瘤，起源于造血干细胞，常伴随患者体质虚弱[1]。骨髓是白血病母细胞和白血病干细胞（LSCs）的主要储存库，在骨髓外扩散前提供独特的代谢微环境，支持恶性细胞的存活[2]。在这个特殊的微环境中，由白血病细胞异常产生的肿瘤坏死因子α（TNF-α）在AML进展中起核心作用[3] [4]。它激活PI3K/AKT信号通路，调节脂质代谢，从而增强白血病细胞的存活能力，促进化疗耐药性，并削弱抗肿瘤免疫反应，这些因素共同促进了免疫逃逸[5] [6] [7]。特别是高TNF-α表达的AML母细胞会抑制抗原呈递，减弱T细胞和自然杀伤（NK）细胞的功能，并在骨髓微环境中促进免疫耐受[8]。同时，TNF-α通过刺激破骨细胞的分化和活性，驱动病理性骨重塑，导致晚期疾病中常见的骨溶解性病变[3] [9] [10]。在缺氧条件下，这些病理效应会加剧，放大TNF-α信号及其下游通路，强化保护性微环境，维持LSC的存活和对治疗的抵抗性[11] [12]。

目前，基于地西他滨的双药组合被认为是AML患者的首选治疗方案。包括地西他滨、维奈托克拉克和阿扎胞苷在内的强化化疗方案通常不适合老年人[13] [14]。我们之前的研究采用“从临床到实验室”的方法，发现AML细胞中miR-497-5p水平的升高使其对维奈托克拉克敏感，并在原位AML小鼠模型中减轻了治疗后的虚弱症状[9]。这些发现强调了将传统化疗与小非编码RNA策略结合的治疗潜力。最近的研究探讨了RNA干扰（RNAi）作为局部抑制AML中TNF-α信号传导的方法[15] [16]。值得注意的是，siRNA介导的TNF-α沉默（siTNF-α）显示出破坏白血病微环境相互作用的潜力。与地西他滨联合使用时，可显著改善AML治疗效果，促进肿瘤细胞死亡，增强凋亡，并提高治疗敏感性，尤其是在AML骨髓的缺氧环境中[17] [18]。

脂质纳米颗粒（LNPs）已成为核酸递送的主要非病毒载体，在ONPATTRO和COVID-19 mRNA疫苗等产品中得到了临床验证[19]。然而，骨髓微环境因其缺氧、低灌注以及血-骨髓屏障（由窦状内皮细胞组成的选择性单层）而给递送带来挑战[20] [21]。尽管存在这些障碍，AML骨髓中富含趋化因子和生长因子（如CXCL12、IL-6和G-CSF），这些因子可以用于引导纳米颗粒的运输，促进血管生成并调节免疫反应[22] [23] [24] [25]。此外，如E-选择素、P-选择素和ICAM-1等粘附分子可促进内皮细胞收缩，增加血管通透性，从而增强向骨髓的治疗递送[26] [27]。基于这些机制，通过工程改造LNPs，添加趋化因子诱导剂和紧密连接调节剂，可以开发出能够有效穿透血-骨髓屏障的骨髓靶向纳米颗粒，用于AML治疗。

本文报道了一种新的“诱饵和渗出”策略，利用骨髓靶向LNPs平台将地西他滨和siTNF-α（BIS-LNPs@DCA-siTNF）直接递送到骨髓微环境中的白血病细胞（图1）。静脉给药后，该系统利用与硝基苯-PEG部分（PEG-CXCR4）结合的CXCR4模拟肽（NVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQC）作为趋化配体，将LNPs锚定在骨髓微环境中。为了促进跨血-骨髓屏障的内皮迁移，LNPs还包含通过DSPE-PEG2000连接的抗CLL-1肽，该肽靶向C型凝集素样分子1（CLL-1），这种分子在AML母细胞中高表达而在正常造血祖细胞中不存在[28] [29]。这一CLL-1相关模块旨在提高对白血病细胞的靶向性，并与CXCR4引导成分共同支持平台的整体骨髓递送效果。特别是在缺氧条件下，硝基苯部分被还原为氨基，使其亲水化并脱落，从而中和局部CXCL12信号，减少滞留，使PEG靶向CLL-1，引导纳米颗粒精确递送到白血病细胞。在AML小鼠模型中，siTNF-α和地西他滨的联合递送增强了T细胞对白血病的反应，改变了脂质代谢，逆转了AML引起的骨质流失，并促进了白血病细胞的清除。我们预计这项研究可能为利用LNPs平台进行肝外核酸递送开辟新的途径，并为血液系统疾病提供新的治疗策略。

材料

N-[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]-L-丙氨酰-L-丙氨酸（Boc-Ala-OH）、3-马来酰亚胺丙酸（MPA）、4-硝基苄基氯甲酸酯（NBC）、地塞米松（DEX）、岩藻多糖和氯丙嗪购自上海阿拉丁生化科技有限公司（上海，中国）。5-氮杂-2′-脱氧胞苷（DCA）购自郑州阿尔法化学有限公司（郑州，中国）。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）

骨髓靶向和白血病选择性配体、前体药物及脂质两亲体的设计与合成

鉴于合成肽在阻断骨髓微环境中的CXCR4/CXCL12轴方面的显著趋化作用，我们应用高亲和力的CXCR4模拟肽（NVSEADDRYICDRFYPNDLWVVVFQFQC）开发了一种骨髓靶向脂质纳米颗粒（LNP）平台[31] [32]。该靶向部分与PEG脂质结构结合，形成PEG-CXCR4，包含三个功能模块：（1）用于骨髓特异性CXCL12的CXCR4模拟肽

讨论

尽管进行了大量研究并取得了治疗进展，但侵袭性髓系白血病患者的治疗预后仍然很差[106] [107]。地西他滨作为一线治疗药物，在AML中广泛使用，但由于其在骨髓中的积累有限且易被胞苷脱氨酶快速失活，导致治疗暴露不足并促使耐药性的产生[108] [109]。同时，基于RNA的疗法虽然有望调节白血病生成途径，但

作者贡献

朱颖：概念提出、研究设计、数据分析、方法学研究、初稿撰写。李秋实：研究设计、数据分析、审稿与编辑。周勇：研究设计、数据分析、方法学研究。吴迪：软件支持、研究设计、数据分析。秦环宇：软件支持、研究设计、数据分析。戴金玉：软件支持、研究设计、数据分析。刘一夫：软件支持、研究设计。杨磊：撰写、审稿与编辑

作者贡献声明

朱颖：初稿撰写、方法学研究、数据分析、概念提出。李秋实：审稿与编辑、研究设计、数据分析。周勇：撰写、审稿与编辑、研究设计、数据分析。吴迪：软件支持、研究设计、数据分析。秦环宇：软件支持、研究设计、数据分析。戴金玉：软件支持、研究设计。刘一夫：软件支持、研究设计。杨磊：撰写

资金来源

国家自然科学基金（82304410、82473864）、江苏省自然科学基金（BK20221045）、国家生物医药技术创新中心（NCTIB2022HS01015）、江苏省基础研究计划（BK20253063）以及中国药科大学的“双一流”计划和国家创新创业培训计划为本研究提供了财政支持

利益冲突声明

不存在需要声明的利益冲突。

致谢

我们感谢中国药科大学的马晓楠在公共实验平台上提供LSM 800共聚焦显微镜的技术支持。作者们还感谢中国药科大学靶标发现中心的高敏辉、戴秦生和李佳的技术支持。同时感谢该校国家重点实验室的蒋伟在PCR仪器使用方面的协助。