《Life Sciences》：SMN deficiency-induced alternative splicing dysregulation in cardiac defects
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为解决脊髓性肌萎缩症(SMA)多系统受累中心脏病变的机制不明问题，浙江大学研究团队聚焦SMN蛋白缺失如何影响出生后心脏发育。研究发现，SMN缺陷通过破坏剪接体snRNP组装，特别是影响SmB的表达与定位，导致Mdm2和Mdm4基因的可变剪接异常，进而激活p53通路，抑制心肌细胞增殖并促进凋亡，最终引发心脏发育缺陷与收缩功能障碍。该研究揭示了SMA相关心脏病理的新机制，提示针对剪接体的干预可能是现有SMA基因疗法的潜在辅助策略。
脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA）是一种由存活运动神经元（Survival Motor Neuron, SMN）蛋白缺乏引起的常染色体隐性遗传病。长久以来，SMA被单纯地视为一种运动神经元疾病。然而，越来越多的临床观察和研究表明，患有SMA的儿童和多种动物模型不仅表现出进行性肌无力和肌肉萎缩，其心脏、肝脏、胰腺等多个器官也受到不同程度的损害，提示SMA可能是一种累及全身多系统的疾病。其中，心脏作为重要靶器官，其损伤的具体表现和背后的分子机制却一直笼罩在迷雾之中。这构成了当前SMA研究领域一个亟待解决的关键问题：SMN蛋白的缺失，究竟是如何“跨界”影响到心脏的发育与功能的？解开这个谜团，不仅对于全面理解SMA的疾病本质至关重要，也可能为开发保护SMA患者心脏功能的新型治疗策略提供关键靶点。
为了回答这个问题，来自浙江大学医学院附属儿童医院的研究团队在《Life Sciences》上发表了一项研究。他们利用一种重症台湾SMA小鼠模型（Smn?/?; SMN2tg/0），深入探究了SMN缺陷如何破坏出生后心脏发育，并试图揭示其潜在的分子机制。
研究人员综合运用了多种关键技术方法。在动物模型层面，他们使用了重症台湾SMA小鼠，并在出生后第1、7、10天等关键时间点采集心脏样本进行分析。表征心脏表型的技术包括组织学分析（H&E和Masson染色）、透射电子显微镜观察心肌超微结构，以及超声心动图评估心脏收缩功能。在分子机制探索层面，他们采集了出生后第7天（P7）SMA小鼠和野生型对照小鼠的心脏组织进行转录组测序，以分析基因表达和可变剪接（Alternative Splicing）的变化，并使用RT-PCR和qPCR对关键事件进行了验证。同时，研究构建了SMN基因敲除（KO）的H9c2心肌细胞模型，并利用小干扰RNA（siRNA）在原代小鼠心肌细胞和H9c2细胞中敲低SMN或SmB（由Snrpb基因编码）的表达，以在细胞水平上研究剪接体小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein, snRNP）组装依赖的机制。此外，还采用了蛋白质印迹、免疫荧光、免疫共沉淀等技术分析相关蛋白的表达、定位及相互作用。
2.1. 出生后SMA小鼠的心脏发育缺陷和收缩功能障碍
研究发现，与野生型小鼠相比，SMA小鼠体型明显更小，心体比在所有检测时间点均显著降低。组织学染色未发现明显的结构病理改变或纤维化，但透射电镜显示SMA小鼠心肌组织中存在大量形态异常的线粒体，表现为肿胀、空泡化和典型密度丧失。此外，心脏损伤标志物心房钠尿因子表达异常升高，心肌肌球蛋白重链同工型Myh7表达显著上调，Myh6/Myh7比值降低，表明心脏基因表达模式向更类似于胎儿期的病理状态转变。超声心动图评估显示，SMA小鼠的左心室射血分数和短轴缩短率均显著降低，表明其心肌收缩功能受损。
2.2. SMN缺失后细胞增殖抑制和凋亡诱导
对小鼠心脏组织的分析发现，SMA小鼠心肌中Ki67阳性的增殖心肌细胞比例在P3和P7时均显著降低，pH 3阳性的细胞在P7时也显著减少。同时，P7时SMA小鼠心肌组织中TUNEL阳性的凋亡细胞数量显著增加。在SMN敲除的H9c2细胞中，EdU掺入率、Ki67和pH 3阳性率也显著下降，这进一步证实了SMN在心肌细胞周期进程和增殖能力中的关键作用。
2.3. SMA小鼠心脏组织中的转录组和可变剪接变化
对P7小鼠心脏的RNA测序分析发现了1588个差异表达基因，这些基因主要富集在细胞周期、p53信号通路和DNA复制等通路。更为重要的是，可变剪接分析揭示了总共1176个差异可变剪接事件，其中外显子跳跃是最主要类型。这些发生差异剪接的基因功能富集在与肌节组织、肌肉收缩和心脏形态发生相关的生物学过程和细胞组分中。
2.4. SMN缺失与Mdm2和Mdm4可变剪接及p53通路激活相关
研究特别关注了与p53激活相关的Mdm2基因第3外显子和Mdm4基因第7外显子的差异剪接。结果显示，在所有三个时间点，SMA小鼠心脏中这两个外显子的包含率均显著低于野生型小鼠。与此一致，p53下游靶基因如Cdkn1a、Perp1、Pmaip1和Bax的mRNA表达在SMA心脏中显著上调，p53蛋白及其磷酸化形式以及p21蛋白的表达也升高。在SMN敲低的原代心肌细胞和H9c2细胞中，同样观察到了Mdm2外显子3和Mdm4外显子7的跳跃剪接事件，并伴随着p53通路靶基因的上调，模拟了体内表型。
2.5. SMN缺失导致SMA心脏组织中剪接体复合物蛋白的表达和定位改变
由于SMN蛋白作为分子伴侣，其核心功能之一是参与剪接体snRNP的组装。研究发现，在P7的SMA小鼠心脏中，剪接体蛋白SmB的表达显著降低，而Gemin5的表达无显著变化。免疫荧光显示，SMA小鼠心肌细胞核内SmB和Gemin5的荧光信号显著减少。在SMN敲除的H9c2细胞中，SmB在细胞核内的定位减少，且SmB与Gemin5之间的相互作用减弱。这些结果表明SMN缺失破坏了剪接体snRNP的正常组装。
2.6. Snrpb缺失与Mdm2和Mdm4的可变剪接事件及p53通路激活相关
为了直接验证SmB在其中的作用，研究者在H9c2细胞中敲低了Snrpb（编码SmB蛋白）基因。结果发现，SmB的缺失同样导致了Mdm2外显子3和Mdm4外显子7的跳跃剪接，并激活了p53信号通路（其下游靶基因表达上调），同时细胞增殖能力（EdU阳性率）下降。这证明SmB的减少足以“重现”SMN缺失所导致的关键剪接异常和细胞表型。
综上所述，本研究的结论清晰地描绘出一条从SMN缺失到心脏缺陷的分子通路。SMN蛋白的缺乏，破坏了其介导的剪接体snRNP的正常组装过程，这一过程与剪接体核心蛋白SmB的表达降低和核内定位异常相关。snRNP组装障碍进而导致广泛的可变剪接失调，其中Mdm2和Mdm4基因的关键外显子跳跃是突出事件。这些剪接异常会产生功能不全的MDM2和MDM4蛋白，它们作为p53蛋白的关键负调控因子，其功能丧失导致p53信号通路被异常激活。活化的p53通路最终通过抑制心肌细胞增殖、促进细胞凋亡等方式，导致心脏发育障碍、线粒体功能异常和收缩功能受损。
这项研究的意义在于，它首次在SMA背景下，将SMN缺陷、剪接体snRNP组装、特定基因（Mdm2/Mdm4）的可变剪接异常、p53通路激活以及最终的心脏表型系统地联系起来，为理解SMA作为一种多系统疾病，特别是其心脏并发症的发病机制提供了崭新的、机制性的解释。它不仅加深了我们对SMN蛋白生理功能的认识，更重要的是，指出了除了直接补充SMN蛋白（当前基因疗法的思路）之外，针对下游的剪接体组装过程或p53通路进行干预，可能成为未来治疗或预防SMA相关心脏病变的潜在辅助策略，为改善SMA患者的整体预后开辟了新的思路。
