专注于膜蛋白的CRISPR筛选发现ATP2A2是肺腺癌中CCND1（周期蛋白D1）的可药物调控的转录共调节因子

《Life Sciences》：Membrane protein-focused CRISPR screen identifies ATP2A2 as a druggable transcriptional co-regulator of CCND1 (cyclin D1) in lung adenocarcinoma

肺腺癌（LUAD）治疗中CDK抑制剂耐药性问题亟待解决。本研究通过膜蛋白靶向CRISPR筛选发现ATP2A2是LUAD细胞周期调控的关键因子，其通过HACD3介导的NF-κB信号通路激活CCND1基因表达，形成CDK4/6复合物驱动细胞周期异常。实验证实姜黄素可抑制ATP2A2活性，在体内外模型中逆转LUAD增殖。

余萌|张子怡|贾坤|王伟|王宏霞|胡志强|刘佳

上海Tech大学生命科学技术学院上海先进免疫化学研究所，201210，上海，中国

摘要

引言

肺腺癌（LUAD）是最常见的非小细胞肺癌（NSCLC）类型之一。最近的研究表明，周期素依赖性激酶（CDK）抑制剂可用于治疗包括NSCLC在内的多种癌症。然而，CDK抑制剂产生的获得性耐药性促使人们探索细胞周期中的可药物调控或补偿途径，作为CDK抑制剂的替代或联合疗法。

目的

本研究旨在利用针对膜蛋白的CRISPR筛选技术在A549细胞中发现LUAD的上游调控蛋白，并解析其功能。

材料与方法

最显著的候选基因ATP2A2是一种内质网（ER）定位蛋白，我们通过细胞增殖实验、迁移和侵袭实验以及凋亡实验对其在LUAD中的作用进行了分析。ATP2A2的机制研究采用了RT-qPCR、Western blotting、RNA-Seq、细胞周期实验、蛋白质免疫沉淀、质谱分析、免疫荧光显微镜等技术。

主要发现

通过公共数据库和收集的临床样本证实了ATP2A2表达与NSCLC之间的关联。ATP2A2通过参与细胞周期调控促进了LUAD的发展。ATP2A2与另一种ER蛋白HACD3相互作用，并共同调节CCND1基因（周期素D1）的转录，后者与CDK4/6形成复合物。ATP2A2和HACD3通过激活NF-κB信号通路及p65蛋白的核转位来促进CCND1的表达，而p65是已知的CCND1转录因子。姜黄素这种针对ATP2A2的天然产物在体外和异种移植小鼠模型中均能抑制LUAD的发展。

意义

本研究揭示了ATP2A2-HACD3-NF-κB作为周期素D1表达的调控轴，并为开发针对LUAD的ATP2A2靶向药物提供了理论基础。

引言

非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最主要的组织学类型，约占所有肺癌病例的85% [1]。NSCLC是全球癌症相关发病率和死亡率的主要贡献者，其5年生存率约为26.4% [2]。流行病学研究表明，肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）是NSCLC中最常见的两种类型 [1]。值得注意的是，在最近几十年中，从未吸烟者和女性人群中LUAD的发病率显著增加，这突显了遗传易感性和环境因素（超出烟草相关风险）的重要性 [3]、[4]、[5]。

得益于生物标志物的发现和分子诊断技术 [6]、[7]，NSCLC的非手术治疗已从传统化疗转向精准医疗，包括靶向治疗和免疫检查点抑制剂 [8]。越来越多的癌症驱动基因和基因突变已被鉴定 [6]，针对这些基因或突变的抑制剂也被开发出来 [9]，并在NSCLC患者中显示出改善的临床效果 [10]。

最近的研究表明，细胞周期失调是NSCLC肿瘤发生的关键机制 [11]、[12]，尤其是周期素D1-CDK4/6-Rb信号通路 [11]、[12]、[13]。编码D-周期素（CCND1/CCND2/CCND3）的基因扩增或重排以及周期素依赖性激酶4/6（CDK4/CDK6）的过表达在22%–25%的NSCLC患者中被观察到 [8]、[14]、[15]。此外，在相当一部分NSCLC病例中观察到CDKN2A（编码CDK4/6抑制蛋白p16^INK4A和p14^ARF的基因）的失活 [12]。这些分子改变会导致周期素D-CDK4/6复合物的持续激活，进而促使视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，从而破坏Rb介导的细胞周期抑制 [16]、[17]、[18]，最终导致细胞增殖失控。

近年来，针对细胞周期失调的药物治疗已成为癌症治疗的重要策略 [19]、[20]。例如，palbociclib、ribociclib和abemaciclib等CDK4/6抑制剂已被批准用于HR阳性/HER2阴性的乳腺癌 [21]。在NSCLC中，临床前研究表明CDK4/6抑制剂作为单药或联合疗法可以有效逆转获得性耐药性，并增强靶向治疗的效果。在A549细胞系中，CDK4/6抑制剂通过阻断CDK4/6激酶活性诱导G1期细胞周期停滞并抑制细胞增殖 [22]。将EGFR抑制剂吉非替尼与CDK4/6抑制剂palbociclib联合使用时，观察到协同效应，在TKI敏感和耐药细胞模型中均表现出更强的肿瘤细胞毒性 [23]。同样，MEK抑制剂selumetinib与palbociclib的联合使用也能达到类似效果 [24]。此外，正在进行的临床试验表明，CDK4/6抑制剂与化疗的联合使用可以在最小化全身毒性的同时优化治疗效果 [20]。

尽管取得了进展，但CDK抑制剂仍面临由多种机制引起的获得性耐药性问题 [25]。例如，CDK6的过表达可能会通过降低对CDK4的依赖性而赋予对CDK4/6抑制剂的内在耐药性 [26]。Rb功能的丧失或通过CDK2-周期素E轴激活的替代通路也可能导致对CDK抑制剂的耐药性 [27]、[28]、[29]。为了解决这些问题，人们提出了发现和靶向CDK介导的细胞周期途径的调控或补偿蛋白的替代方法 [25]。

基于CRISPR的基因筛选已被证明是识别癌症治疗靶点的高效方法 [30]、[31]、[32]。我们之前建立了两个分别针对1433（v1.0）和5622（v2.0）膜蛋白的CRISPR文库 [33]、[34]。这些文库已被用于研究宿主-病原体相互作用 [33]、[34]、[35]。在本研究中，我们使用针对膜蛋白的CRISPR文库v2.0在A549细胞中进行了筛选，以识别LUAD特异性的驱动基因。我们鉴定并验证了一系列对LUAD肿瘤发生至关重要的候选基因，包括ATP2A2。后续分析揭示了ATP2A2在调节LUAD中周期素D1-CDK4/6介导的细胞周期中的作用机制。我们还研究了针对ATP2A2的天然产物姜黄素在体外和体内治疗LUAD的效果。

实验部分

小鼠

我们从GemPharmatech（南京，中国）购买了五周大的雌性BALB/c裸鼠和四周大的雄性NCG小鼠。所有小鼠均在无病原体环境下饲养，可自由摄取食物和经过高压灭菌处理的水。小鼠生活在12小时光照/黑暗周期的环境中，室温为21–26°C，湿度为50–70%。

细胞培养

HEK-293T、A549、NCI-H1299、HCC827和NCI-H2228细胞购自上海生物科学研究院（SIBS）的细胞库。

在A549和HEK-293T中进行的膜蛋白聚焦CRISPR筛选鉴定出A549特异性的关键基因

为了识别NSCLC特异性的关键基因，我们在A549 LUAD细胞和作为对照的HEK-293T细胞中进行了针对膜蛋白的基因筛选 [34]。CRISPR文库包含22,631个靶向质膜、内膜系统和细胞外区域的sgRNAs（图1A）。通过将携带文库的慢病毒（LVs）转导到A549或HEK-293T细胞系中构建了细胞文库。细胞被允许增殖一到两周后...

讨论

靶向治疗和免疫疗法已成为早期和晚期NSCLC患者的治疗关键选择 [8]。尽管这些治疗方法取得了显著进展，但由于疾病的异质性、反应不一以及获得性耐药性的存在，NSCLC的治疗仍面临诸多挑战 [8]、[58]。因此，发现新的可药物靶点对于NSCLC的治疗变得越来越重要。

结论

总结来说，本研究首次通过CRISPR筛选确定了ATP2A2在LUAD细胞增殖中的作用。随后的机制研究表明，ATP2A2通过ATP2A2-HACD3-NF-κB调控轴特异性调节周期素D1的表达，阐明了LUAD中异常细胞周期进展的关键上游分子通路。此外，实验数据证实，天然化合物姜黄素对LUAD肿瘤具有抑制作用。

缩写

LUAD
肺腺癌
LUSC
肺鳞状细胞癌
NSCLC
非小细胞肺癌
EGFR
生长因子受体
TKI
酪氨酸激酶抑制剂
ER
内质网
CDK 4/6
周期素依赖性激酶4/6
PI3K
磷脂酰肌醇3-激酶
AKT
v-Akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物
NFAT
活化T细胞的核因子
CREB
CAMP反应元件结合蛋白

CRediT作者贡献声明

余萌：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，方法学研究，数据分析，概念化。张子怡：方法学研究，实验设计。贾坤：实验设计。王伟：数据分析。王宏霞：资源准备。胡志强：资源准备。刘佳：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，项目监督，资金筹集，数据分析，概念化。

知情同意

所有参与患者均获得了知情同意。未向参与者提供任何补偿。

伦理批准

所有动物实验均遵循《实验动物护理和使用指南》进行，并获得了上海Tech大学研究伦理委员会的批准（批准编号：20230821001和20250928003）。

所有肿瘤患者样本均来自复旦大学附属肿瘤医院。该临床研究获得了复旦大学上海癌症中心伦理委员会的批准（批准编号：050432-4-2307E）。

资金支持

本研究得到了上海市科学技术委员会资助的上海生物大分子与精准医学前沿科学中心的支持（2022A0301-417-01）。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：刘佳表示获得了上海市科学技术委员会的资金支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢上海Tech大学先进免疫化学研究所（SIAIS）发现技术平台的L.S Zhang和P.W. Zhang在流式细胞实验方面的支持；感谢同一平台的H.Z Liu在免疫荧光实验方面的支持；以及生命科学技术学院多组学核心设施的C.Q Zhang在实验支持方面的协助。