《Materials Today Bio》：Smart ROS-Regulating Biomimetic Hydrogel Promotes Scarless Diabetic Wound Healing via Macrophage Reprogramming
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慢性糖尿病伤口因病理微环境的动态差异和药物递送障碍，其愈合管理面临重大挑战。为解决此问题，研究者受土木工程中三维钢筋-混凝土复合结构启发，开发了一种核壳结构微纤维复合水凝胶(Bil)。该平台通过动态调节ROS和免疫微环境实现程序化治疗：初期在激光照射下产生抗菌ROS；随后ROS响应性外壳降解，释放干细胞来源的外泌体(Exos)促进再生，暴露的纳米纤维内核则清除ROS并促进炎症向增殖阶段转换；同时，释放的维替泊芬通过阻断成纤维细胞中Engrailed-1 (En1)活化抑制瘢痕形成。该研究为糖尿病伤口提供了时空阶段适应性疗法，通过动态ROS调节、精确免疫调控和改善的外泌体递送，显著促进无疤痕伤口再生。
糖尿病足溃疡等慢性伤口是临床上的重大难题，全球超过25%的糖尿病患者受其困扰。其愈合过程犹如一场被“卡住”的交响乐，正常的止血、炎症、增殖和重塑四部曲被打乱。罪魁祸首是高血糖诱导的活性氧(ROS)过度产生，它形成了一个恶性循环：持续的氧化应激和免疫失调将伤口“困”在慢性炎症阶段，导致血管新生不足、细胞外基质(ECM)沉积异常，最终形成功能障碍的组织修复和纤维化疤痕。传统治疗策略常常是“单点突破”，比如单纯清除ROS或递送生长因子，却难以应对伤口微环境的动态变化和不同愈合阶段的差异化需求。这就像只用一种工具去修理一台时刻在变化的精密仪器，往往力不从心。那么，能否设计一种智能材料，像“随症施治”的医生一样，动态感知并响应伤口不同阶段的变化，精确调控微环境，最终实现功能性、无疤痕的完美再生呢？
为了回答这一问题，由Pan Du、Jin Li、Jun Pu、Shuqian Dou、Gaofei Zhang、Kongjia Wu、Shihao Deng、Qiulei Wang、Wenjun Liu组成的团队（来自昆明医科大学第二附属医院）在《Materials Today Bio》上发表了一项创新研究。他们从土木工程中的三维钢筋-混凝土复合结构中汲取灵感，匠心独运地设计了一种仿生核壳结构微纤维复合水凝胶(Bil)，旨在为糖尿病伤口提供一种能够时空程序化、阶段适应性治疗的智能解决方案。
研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：1. 材料工程与表征：通过静电纺丝技术制备丝胶蛋白-明胶(SF-GT)复合纳米纤维作为“钢筋”内核，并通过TSPBA交联的聚乙烯醇(PVA)形成ROS响应的“混凝土”外壳，构建核壳结构Bil水凝胶。利用扫描电镜(SEM)、力学测试等手段系统表征了材料的形貌、结构、机械性能（如抗撕裂性）和保水性（通过添加甘油改良为Bil-Gly）。2. 药物/生物活性分子负载与控释：将抗氧化剂表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)负载于内核，将光敏剂维替泊芬(VP)和人脐带间充质干细胞来源的外泌体(hUC-MSCs-Exos)负载于外壳。通过PLGA纳米颗粒封装Exos以增强其稳定性和缓释性能。系统研究了材料在不同ROS环境（如H2O2）下的降解动力学及各活性成分的释放曲线。3. 细胞与分子生物学实验：分离并鉴定了hUC-MSCs及其来源的Exos。通过细胞划痕实验、Transwell迁移实验、EdU增殖实验、体外成管实验等，评估了Bil对成纤维细胞(L929)、血管内皮细胞(HUVEC)的迁移、增殖、胶原分泌及血管生成能力的影响。通过DCFH-DA荧光探针、ABTS/DPPH自由基清除实验评估了材料的ROS生成与清除能力。利用RAW 264.7巨噬细胞，通过形态学观察、免疫荧光染色(CD86/CD163)和qPCR，研究了材料对巨噬细胞M1/M2极化的调控作用。4. 抗菌与抗生物膜评价：通过菌落计数、活/死细菌染色、扫描电镜观察，评估了材料在激光照射下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌及抗生物膜功效。5. 体内动物模型验证：建立了链脲佐菌素诱导的糖尿病C57BL/6小鼠全层皮肤缺损感染模型，通过伤口愈合率观测、组织细菌培养、组织病理学染色(H&E, Masson, Sirius Red)、免疫荧光染色(CD31, α-SMA, CD86, CD163)等手段，综合评价Bil水凝胶在体内的促愈合、抗菌、促血管生成、免疫调节及抑制瘢痕的效果。并利用兔耳增生性疤痕模型进一步验证其抗瘢痕功效。6. 转录组学分析：对愈合后期伤口组织进行RNA测序(RNA-seq)，通过差异表达基因分析、GO富集分析、KEGG通路分析和基因集富集分析(GSEA)，深入探讨Bil水凝胶促进伤口愈合的分子机制。
研究结果
2.1. Bil的制备与表征
成功制备了具有仿生结构的核壳复合水凝胶。内核为由静电纺丝制备的SF-GT纳米纤维，平均直径在200-800 nm，形成多孔网络结构，有利于细胞浸润和物质交换。外壳为PVA与ROS响应性交联剂TSPBA形成的PVA-TSPBA水凝胶，呈现均匀的半透明外观和多孔结构。扫描电镜证实外壳完全且均匀地包裹了内核，形成了完整的核壳结构。力学测试表明，Bil水凝胶具有优异的机械性能，其拉伸强度和断裂应变均显著优于单纯的PVA-TSPBA水凝胶，并表现出卓越的抗撕裂性。此外，通过添加甘油制备的Bil-Gly有效改善了水凝胶的保水性能，防止了在环境中过快脱水。这些特性为Bil在动态伤口环境中的应用奠定了坚实的物理基础。
2.2. PLGA-Exos的制备与表征
成功从hUC-MSCs中分离出外泌体(hUC-MSCs-Exos)，透射电镜显示其典型的杯状形态，纳米颗粒追踪分析显示其粒径分布在60-160 nm，Western blot验证了其表达TSG101、CD63等外泌体标志物。通过双乳液溶剂蒸发法将Exos封装进PLGA纳米颗粒中，形成了PLGA-Exos，扫描电镜显示其形貌均匀。释放实验表明，PLGA-Exos可实现Exos的持续释放，15天内累积释放超过80%。细胞实验证实，PKH26标记的Exos能被成纤维细胞和血管内皮细胞内化。共聚焦显微镜图像显示了PLGA-Exos在PVA-TSPBA水凝胶外壳中的三维空间分布。
2.3. ROS响应性
Bil水凝胶的ROS响应性外壳是其实现阶段适应性治疗的核心。降解实验表明，PVA-TSPBA外壳在模拟慢性伤口ROS水平(1 mM H2O2)的环境中，于40小时内完全降解。这种程序化降解控制了内部活性成分的释放：在外壳降解的早期，负载于外壳的VP快速释放；随着外壳降解，内核中的EGCG得以释放，发挥抗氧化作用；而封装在PLGA中的Exos则依赖PLGA的缓释机制，在ROS触发外壳降解后，能够持续释放长达15天，与伤口增殖期的需求相匹配。这种设计实现了对VP（早期抗菌）、EGCG（中期抗氧化）和Exos（长期促再生）的时空程序化控释。
2.4. 生物相容性
通过体外细胞毒性实验(CCK-8)、活/死细胞染色、细胞骨架染色证明，Bil及其各组分对L929成纤维细胞无毒性，并能支持细胞正常粘附和铺展。溶血实验表明Bil材料具有良好的血液相容性，溶血率低于临床安全阈值。体内皮下植入实验14天后，对主要器官（心、肝、脾、肺、肾、皮肤）进行H&E染色，未发现炎症、坏死或结构扭曲等不良反应，证实了材料的系统生物安全性。
2.5. 对成纤维细胞和血管内皮细胞的作用
细胞功能实验表明，Bil水凝胶能显著促进L929成纤维细胞的迁移（划痕实验和Transwell实验）和增殖（EdU实验），并增强其I型和III型胶原的分泌。同时，Bil能有效促进HUVEC血管内皮细胞的迁移、增殖，并在体外基质胶成管实验中显著增加血管分支数量、总长度和网格数量，表明其强大的促血管生成能力。这些效应主要归因于持续释放的hUC-MSCs-Exos的生物活性。
2.6. Bil对ROS的调控评价
研究证实了Bil水凝胶的双相ROS调控能力。一方面，在激光照射下，负载于外壳的VP能有效产生ROS，通过亚甲基蓝降解实验得以验证。另一方面，内核负载的EGCG具有强大的自由基清除能力，ABTS和DPPH实验证明了其体外抗氧化活性。在细胞内，EGCG能有效清除H2O2诱导的ROS，保护L929细胞、HUVEC和RAW 264.7巨噬细胞免受氧化损伤。这种“先产生后清除”的动态ROS管理策略，模拟了生理愈合过程中早期需要ROS抗菌、后期需要清除过量ROS以利再生的需求。
2.7. 免疫反应的调节
巨噬细胞的M1/M2表型平衡对伤口愈合至关重要。研究表明，Bil内核释放的EGCG能有效调节巨噬细胞极化。在脂多糖(LPS)刺激的炎症环境下，EGCG处理能促使RAW 264.7巨噬细胞从促炎的M1表型（CD86+，高表达iNOS、TNF-α、IL-6）向促再生的M2表型（CD163+，高表达Arg1、IL-10、CD206）转变。这为Bil水凝胶在体内缓解慢性炎症、促进愈合提供了关键的细胞免疫学机制。
2.8. 抗菌特性
体外抗菌实验表明，Bil水凝胶在激光照射下（690 nm, 15分钟）对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出接近100%的杀菌率，其效果显著优于无激光照射组或未负载VP的对照组。扫描电镜观察显示，经Bil+激光处理的细菌出现膜破损和胞质渗漏。此外，Bil+激光处理还能有效破坏和抑制这两种细菌形成的生物膜，结晶紫染色和活/死染色证实了其对生物膜内细菌的杀灭和对生物膜结构的破坏作用。
2.9. 在糖尿病小鼠感染伤口模型中的体内伤口愈合
在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型中，Bil水凝胶（尤其结合激光照射）展现了卓越的促愈合效果。宏观观察显示，Bil+激光组在第7天伤口愈合率即达到81.42%，显著高于对照组（51.77%）及其他治疗组，并在第14天基本实现完全上皮化。该组伤口部位的细菌载量也最低。组织学分析（H&E和Masson染色）显示，Bil+激光治疗促进了更厚、更有序的肉芽组织形成和胶原沉积。免疫荧光显示，该治疗显著增加了伤口部位的CD31+血管和α-SMA+成熟血管的数量，促进了血管新生。同时，减少了促炎M1型巨噬细胞(CD86+)的浸润，增加了促修复M2型巨噬细胞(CD163+)的数量，有效调节了伤口免疫微环境。
2.10. 微纤维复合水凝胶的伤口愈合机制
对愈合后期伤口组织的RNA测序分析揭示了Bil作用的分子网络。差异基因表达、GO和KEGG富集分析表明，Bil+激光治疗上调了与伤口愈合、血管生成、细胞迁移、胶原形成和ECM组织相关的基因通路，同时下调了与纤维化、炎症反应（如NF-κB信号通路）相关的基因。基因集富集分析(GSEA)进一步确认了NF-κB、IL-10信号、细胞凋亡、胶原形成等通路在Bil介导的伤口修复中的关键作用。这些数据从转录组水平阐明了Bil通过多通路协同作用，促进再生、抑制炎症和纤维化的综合机制。
2.11. 微纤维复合水凝胶促进无疤痕愈合
在更能模拟人类疤痕形成的兔耳增生性疤痕模型中进一步验证了Bil的抗疤痕效果。结果显示，负载VP的Bil水凝胶治疗能显著降低疤痕隆起指数(SEI)和疤痕厚度。天狼星红偏振光显微镜显示，VP治疗增加了III型胶原（绿色）相对于I型胶原（橙红色）的比例，这是再生性修复而非纤维化修复的标志。其机制在于VP通过抑制YAP信号通路，阻断了成纤维细胞中Engrailed-1 (En1)的激活，从而抑制了成纤维细胞向促纤维化的肌成纤维细胞转化，最终实现了疤痕抑制下的高质量愈合。
结论与讨论
该研究成功地设计并验证了一种受土木工程启发的、智能ROS调节的仿生核壳结构水凝胶(Bil)。它创新性地解决了糖尿病伤口愈合中的核心矛盾——不同阶段对ROS的相反需求，以及慢性炎症与组织再生之间的冲突。Bil通过其精巧的时空程序化设计，实现了“一体三相”的协同治疗：在炎症早期，通过激光激活VP产生抗菌ROS，清除感染；随着炎症发展，ROS响应性外壳降解，释放EGCG清除过量的ROS，并将巨噬细胞从促炎的M1表型重编程为促再生的M2表型，打破炎症循环；在增殖重塑期，持续释放的hUC-MSCs-Exos强力促进成纤维细胞和血管内皮细胞的活化、迁移、增殖及基质重建，驱动血管新生和组织修复；同时，VP通过抑制YAP-En1通路，有效阻断了成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，从而在快速愈合的同时抑制了疤痕形成。
这项研究的重大意义在于，它超越了传统伤口敷料或单一疗法“头痛医头，脚痛医脚”的局限，提出了一种“材料引导的微环境重编程”治疗新范式。Bil水凝胶作为一个智能平台，能够动态感知并适应伤口愈合的阶段性病理生理变化，主动、精准地调控氧化还原平衡、免疫反应和细胞行为，将紊乱的愈合过程“拨乱反正”，导向一个功能性、无疤痕的理想再生结局。其仿生设计理念、阶段适应性的治疗策略以及对多重生物学过程的协同调控能力，为慢性难愈性伤口，特别是糖尿病足溃疡的治疗，提供了一个极具转化潜力的创新解决方案，也为开发其他复杂组织再生材料提供了新的设计思路。
