《Materials Today Bio》：The utilization of a magneto-fluorescence sequential labeling strategy for the visualization and tracking of intestinal translocation of oral microbiota
编辑推荐：
本研究针对现有测序技术难以区分口腔-肠道轴菌群易位过程中活菌定植与残留DNA的瓶颈，通过构建一种聚丙烯酸和3-叠氮-D-丙氨酸修饰的磁性复合微球（MSP@PAA-ADA），并结合Cy5ADA荧光探针，建立了一种磁-荧光序贯标记新策略。该策略实现了对肠道内口腔来源活菌的时空调控追踪与活性同步评估，为深入解析口腔-肠道菌群轴的生物学机制与致病作用提供了创新性技术工具。
口腔与肠道作为人体内微生物最为密集的两个“部落”，它们之间并非孤立存在，而是通过一条被称为“口腔-肠道菌群轴”的隐秘通道紧密相连。大量研究表明，这条轴线的菌群紊乱与多种疾病，包括炎症性肠病、结直肠癌等息息相关。然而，一个核心难题长期困扰着研究者们：我们如何确切地知道，哪些来自口腔的细菌真的“活”着抵达了肠道，并成功“安家落户”，而非仅仅是死去细菌残留的DNA信号？传统的高通量基因测序技术虽然能告诉我们“谁在那里”和“有多少”，却无法分辨它们是生机勃勃的“殖民者”还是历史的“遗骸”。这种对活菌动态定植过程观察能力的缺失，严重阻碍了人们揭示口腔菌群如何影响肠道乃至全身健康的精确机制。
为了突破这一技术瓶颈，上海交通大学医学院附属第九人民医院的研究团队在《Materials Today Bio》上发表了一项创新性研究。他们独辟蹊径，将磁性纳米技术与荧光代谢标记相结合，开发了一套全新的“磁-荧光序贯标记”策略，如同为口腔细菌装上了“磁力追踪器”和“活性指示灯”，首次实现了对肠道内活体口腔来源细菌的时空调控追踪与活性同步评估。这项研究不仅提供了一种强大的研究工具，更为深入理解口腔-肠道轴在健康和疾病中的作用打开了新局面。
研究者们开展这项工作的核心技术方法主要包括：首先，他们设计并合成了表面修饰有3-叠氮-D-丙氨酸的磁性复合微球（MSP@PAA-ADA），其粒径约160纳米，具有良好的亲水性、高超顺磁性（饱和磁化强度33 emu/g）和低细菌毒性。其次，他们利用该微球与细菌细胞壁肽聚糖的特异性结合能力，在体外高效标记口腔唾液菌群。接着，将标记后的菌群灌胃给予C57BL/6J小鼠，通过活体近红外荧光成像系统追踪其在肠道内的动态分布。最后，在特定时间点，从肠道（如盲肠）内容物中利用磁力快速分离出被标记的口腔来源细菌，并结合另一种荧光D-氨基酸探针Cy5ADA进行序贯标记，通过激光共聚焦显微镜和透射电镜等验证分离细菌的活性和微球结合情况。整个过程中还辅以16S rRNA基因测序分析菌群结构变化。
3.1. MSP@PAA-ADA的制备与表征
研究人员成功制备了核心为Fe3O4纳米簇、外壳为交联聚丙烯酸（PAA）、并最终通过点击化学接枝上3-叠氮-D-丙氨酸（ADA）的磁性复合微球（MSP@PAA-ADA）。表征结果显示，该微球粒径均一，水合直径约为160纳米，分散性良好，表面带负电（ζ电位约-21 mV），并具有超顺磁性。傅里叶变换红外光谱和热重分析证实了ADA的成功修饰，饱和磁化强度虽因聚合物包覆有所下降，但仍能在60秒内实现快速磁分离。
3.2. MSP@PAA-ADA在体外标记细菌的性能
以具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）为模型菌的测试表明，在浓度不高于0.1 mg/mL时，MSP@PAA-ADA对细菌生长无明显毒性，活/死染色也证实其不影响口腔唾液菌群的活性。该微球能通过其表面的ADA结构与细菌细胞壁新合成的肽聚糖结合，实现对细菌的高效标记（标记效率约88%），并可被磁铁快速吸附富集。革兰氏染色显示，被吸附的菌群种类多样，包括革兰氏阳性菌和阴性菌。
3.3. MSP@PAA-ADA标记菌群的群落结构与物种组成
通过对标记前后口腔唾液菌群进行16S rRNA测序分析发现，MSP@PAA-ADA能够广泛结合多种细菌，并不影响群落的物种总数（丰富度无显著差异）。但Shannon指数降低，表明其导致了群落内物种分布均匀度的下降。线性判别分析（LEfSe）进一步揭示，MSP@PAA-ADA对弯曲菌门（Campylobacterota）、奈瑟菌科（Neisseriaceae）和普雷沃菌科（Prevotellaceae）等特定类群具有更高的捕获效率。
3.4. MSP@PAA-ADA/Cy5ADA双标记追踪口腔菌群向肠道的易位
将口腔唾液菌群与MSP@PAA-ADA及Cy5ADA荧光探针共同孵育后，通过磁分离获得双标记菌群。将其灌胃给予小鼠后，活体近红外成像动态显示，荧光信号在灌胃后3小时已遍布胃肠道，并于9小时左右在盲肠区域出现显著聚集，随后信号逐渐减弱，直至36小时仍可检测到微弱信号。这直观地证明了经标记的口腔菌群能够沿着消化道易位，并在肠道内停留较长时间。
3.5. MSP@PAA-ADA与Cy5ADA序贯标记揭示易位后口腔菌群在肠道内的活性
为了验证易位至肠道的口腔菌群是否仍具活性，研究者采用了更为严谨的序贯标记策略：先将菌群用MSP@PAA-ADA标记后灌胃，3小时后再给小鼠灌入Cy5ADA探针，6小时后收集盲肠内容物并进行磁分离。结果令人振奋：磁分离得到的细菌在激光共聚焦显微镜下呈现红色荧光，证明它们成功摄取了后来给予的Cy5ADA。透射电镜照片清晰地显示MSP@PAA-ADA微球吸附在细菌表面。活/死染色对比显示，从盲肠回收的细菌与灌胃前相比，活性未发生显著变化。这些证据链共同表明，经MSP@PAA-ADA标记的口腔菌群在进入小鼠胃肠道数小时后，仍然保持着代谢活性，是具有生命力的“活菌”。
这项研究的结论与讨论部分深刻阐释了其重要意义。该工作成功构建的磁-荧光序贯标记策略，创新性地解决了在复杂肠道环境中特异性地追踪、富集并确认口腔来源活菌的难题。MSP@PAA-ADA微球作为一种新型的生物相容性磁珠，能够在不影响细菌活性的前提下实现高效、广谱的标记，其磁性特性使得从大量肠道内容物中快速分离目标菌群成为可能，克服了传统荧光激活细胞分选等技术在操作上的局限。而后续的Cy5ADA序贯标记，则如同一个“活性验讫章”，只有那些仍在进行细胞壁合成等代谢活动的活菌才能被点亮，从而将活菌定植与死菌残留明确区分开来。
该方法使得研究者能够在活体动物中实时、纵向地观察口腔菌群肠道易位的时空动态，并能将感兴趣的活菌群体“捕获”出来，供后续的组学分析或功能研究，实现了从“观察相关性”到“操纵并验证因果性”的关键一步。这为未来深入研究特定口腔病原菌如何突破肠道屏障、诱发局部或全身性炎症、乃至影响代谢和癌症发生等具体机制，提供了一个强大而灵活的平台。尽管目前研究主要在小鼠模型中验证，但其展现的技术原理和潜力，为未来探索人类口腔-肠道菌群轴在健康和疾病中的作用，以及开发基于菌群干预的新策略，铺就了一条充满希望的道路。
