《Neurobiology of Disease》：lncRNA
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ENSG00000272070 modulates microglial inflammatory programs in association with PU.1
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本研究探讨了胶质细胞富集的长链非编码RNA（lncRNA）Glelr及其人类同源物GLELR在衰老和神经退行性疾病背景下对小胶质细胞功能的调控。通过在小鼠原代小胶质细胞和iPSC来源的人小胶质样细胞中进行功能缺失实验，研究人员发现Glelr/GLELR缺失可增强促炎细胞因子TNFα的表达、提高小胶质细胞的吞噬活性，并改变神经元网络活动。机制研究表明，该lncRNA与小胶质细胞关键转录因子PU.1相互作用，调控与肿瘤坏死因子（TNF）和补体信号通路相关的基因表达。尤为重要的是，在阿尔茨海默病（AD）患者死后脑组织中，GLELR表达显著降低，且Glelr调控的基因与AD相关基因存在显著重叠。该研究揭示了一个保守的、与衰老相关的lncRNA通过PU.1调控小胶质细胞炎症状态的分子轴，为理解AD相关神经炎症提供了新视角，并提示GLELR是调节神经退行性疾病中小胶质细胞活性的潜在分子靶点。
在人类基因组中，仅有约1.5%的序列负责编码蛋白质，而绝大部分转录产物属于功能未知的非编码RNA组。长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）作为其中重要的一员，是大脑功能的关键调节者，但其在小胶质细胞衰老和神经退行性疾病中的作用仍不明确。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，负责免疫监视、清除细胞碎片并通过维持突触和稳态信号来支持神经元网络。然而，在衰老过程中，小胶质细胞会发生深刻的分子和功能改变，转向一种慢性激活、功能失调的状态，这被认为是驱动阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）、帕金森病等神经退行性疾病的重要因素。尽管转录组学研究揭示了小胶质细胞存在广泛的年龄相关重编程，但其潜在的调控机制仍知之甚少。因此，探索lncRNA如何影响小胶质细胞功能，对理解神经退行性疾病的发病机制和寻找新的治疗靶点具有重要意义。
本研究由Ranjit Pradhan、Andre Fischer等人合作完成，并发表在《Neurobiology of Disease》期刊上。研究人员此前已鉴定出在小鼠衰老海马中表达上调的胶质细胞富集lncRNA——Glelr，并发现其在星形胶质细胞中通过与转录因子Npas3相互作用来调节神经元支持和突触组织。然而，Glelr同样在小胶质细胞中表达，其在小胶质细胞生物学中的功能从未被研究过。鉴于小胶质细胞在神经炎症和神经退行过程中的核心作用，本研究旨在探究Glelr如何影响小胶质细胞功能，以及其调控网络是否与AD相关通路重叠。该研究为此设定了四个目标：1. 在转录组和功能水平上确定Glelr在小胶质细胞中的调控作用；2. 在人多能干细胞（iPSC）来源的小胶质细胞中验证其人类同源物GLELR的作用；3. 评估GLELR在AD患者死后脑组织中的表达，并分析AD相关基因与Glelr调控基因之间的转录组重叠；4. 识别Glelr的转录因子结合伙伴，阐明其在AD中介导小胶质细胞调控的分子机制。
为开展研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：1. 利用反义锁核酸（LNA）GapmeR在小鼠原代小胶质细胞和人iPSC来源的小胶质样细胞（iPSC-derived microglia-like cells, iMGLs）中进行lncRNA的敲低（knockdown, KD）。2. 对敲低后的细胞进行全转录组RNA测序（RNA-seq），以分析差异表达基因并进行基因本体（Gene Ontology, GO）和转录因子富集分析。3. 通过RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）和染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）技术，探究lncRNA与转录因子PU.1的相互作用及其对靶基因启动子的结合影响。4. 采用吞噬功能实验和微电极阵列（multi-electrode array, MEA）记录，分别评估小胶质细胞的吞噬活性和小胶质细胞-神经元共培养体系中神经元网络的电生理活动。5. 使用公共数据库（如AGORA AD数据库、DisGeNET）和已发表的单细胞/细胞核RNA测序数据集，分析lncRNA和PU.1在AD患者脑组织中的表达情况。研究所用的人类脑组织样本（前额叶皮层，BA9区）来自对照和AD患者（Braak分期IV期），由哈佛脑组织资源中心提供。
3.1. lncRNA Glelr调节小鼠小胶质细胞的细胞因子产生和吞噬活性
研究人员首先确认了Glelr在原代小鼠小胶质细胞的细胞核和细胞质中均有表达。通过反义寡核苷酸（ASO）有效敲低Glelr后，RNA测序显示，敲低引起了广泛的转录组变化，其中384个基因上调，仅12个基因下调。GO分析表明，上调的基因主要富集在肿瘤坏死因子（TNF）信号传导和细胞因子产生相关通路。功能实验证实，敲低Glelr后，小胶质细胞的Tnfα mRNA表达水平升高，吞噬活性增强。此外，在将敲低了Glelr的小胶质细胞与神经元进行共培养后，通过微电极阵列记录发现，神经元网络的整体活动评分、平均放电频率和网络爆发频率均下降，但树突棘和突触密度未受影响。这表明Glelr缺失使小胶质细胞倾向于促炎、高吞噬状态，并通过功能性机制（如细胞因子介导的突触效能调节）抑制网络活性，而非导致结构性的突触丢失。
3.2. lncRNA Glelr的人类同源物GLELR调节iPSC来源的人小胶质样细胞的细胞因子产生和吞噬活性
为验证功能的保守性，研究在iPSC来源的人小胶质样细胞中进行了平行实验。同样，人类同源物ENSG00000272070（即GLELR）也主要定位于细胞核。敲低GLELR后，人小胶质样细胞的TNFα表达水平和吞噬活性均显著增加。这些结果表明，小鼠Glelr和人GLELR在调节TNFα信号和吞噬功能方面具有相似的作用。
3.3. lncRNA Glelr/GLELR在AD中失调并诱导类似于AD的转录组和功能变化
为了探究GLELR与AD的相关性，研究人员检测了其在AD患者死后前额叶皮层中的表达，发现GLELR水平显著降低，而在帕金森病、额颞叶痴呆或精神分裂症患者脑中未发现显著变化。进一步分析显示，在小鼠小胶质细胞中敲低Glelr所上调的基因，与从DisGeNET数据库获得的AD相关基因存在103个的重叠，这些基因富集在“神经退行”、“阿尔茨海默病”和“吞噬体”等通路。对公共单细胞/细胞核RNA测序数据的分析也证实，在AD患者的微胶质细胞中，GLELR的表达显著下调。此外，用脂多糖（LPS）或Aβ刺激原代小胶质细胞会导致Glelr表达下调，提示其在微胶质细胞激活过程中受到动态调节。
3.4. lncRNA Glelr与小胶质细胞特异性转录因子PU.1相互作用
为阐明机制，研究人员对Glelr敲低后上调的基因进行转录因子富集分析，发现髓系谱系关键转录因子PU.1（由Spi1基因编码）是最显著富集的转录因子。PU.1对微胶质细胞的身份和功能至关重要，且与AD风险遗传相关。RNA免疫共沉淀实验证明，Glelr及其人同源物GLELR均能与PU.1蛋白发生物理结合。对已发表的PU.1敲低数据集进行交叉分析发现，约33%的Glelr调控基因与PU.1靶基因重叠，其中包括Tnfα。染色质免疫共沉淀实验进一步证实，敲低Glelr后，PU.1在Tnfα启动子区域的结合增加。生物信息学分析预测，Glelr/GLELR的序列中存在可能形成G-四链体（G-quadruplex）的区域，并且这些区域与预测的PU.1结合位点重叠，这可能为二者的相互作用提供了结构基础。这些数据支持了一个模型：Glelr作为PU.1的分子诱饵，限制其与靶基因（特别是与TNFα信号相关的基因）的结合；而在AD中观察到的Glelr表达缺失，则会增强这些基因的表达。
研究结论与意义
本研究首次系统地揭示了胶质细胞富集的lncRNA Glelr/GLELR在调控小胶质细胞功能中的关键作用及其在阿尔茨海默病中的病理意义。研究得出以下核心结论：
- 1.
功能鉴定：Glelr/GLELR是一个衰老相关的保守lncRNA，其功能缺失会驱动小胶质细胞向促炎状态转化，具体表现为TNFα表达上调、吞噬活性增强以及与神经元共培养时神经元网络活动受到抑制。
- 2.
疾病关联：该lncRNA的人类同源物GLELR在AD患者脑组织及小胶质细胞中表达显著降低，且Glelr调控的基因集合与已知的AD相关基因存在显著重叠，提示其参与AD相关病理过程。
- 3.
机制阐释：Glelr通过与小胶质细胞主调控转录因子PU.1发生相互作用，发挥“分子诱饵”的功能，从而抑制PU.1对其下游靶基因（如Tnfα）的转录激活。这揭示了一条全新的lncRNA-PU.1调控轴。
- 4.
治疗启示：该研究将胶质细胞lncRNA的调控与AD相关神经炎症联系起来，表明GLELR是一个潜在的治疗靶点。通过调控GLELR的表达或功能，可能实现对小胶质细胞活性的精准“微调”，为开发针对神经退行性疾病中神经炎症的新疗法提供了新的思路和方向。
总之，这项工作不仅拓展了对非编码RNA在脑衰老和疾病中作用的认识，也为理解小胶质细胞功能失调的深层调控机制提供了重要见解，凸显了靶向lncRNA-PU.1轴在干预阿尔茨海默病等神经退行性疾病中的潜在价值。
