《NeuroToxicology》：Intranasal rosmarinic acid reduces cognitive and hippocampal damage from repeated neonatal isoflurane exposure by regulating apoptotic/oxidative/inflammatory responses, and heat-shock and 14-3-3 proteins.
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本研究首次评估鼻腔给药迷迭香酸（RA）对反复异氟烷暴露引起发育中脑神经毒性的保护作用。实验显示RA预处理逆转了ISO导致的海马体氧化应激、炎症及凋亡（Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3、PARP1），调节热休克蛋白（p-HSF1、Hsp90、Hsp60）和14-3-3表达，改善Morris水迷宫测试中的学习记忆功能，为儿科麻醉神经保护提供新策略。
Serdar DEM?RGAN | Asl?han ?ENGELEN | Yunus AKSüT | ?rem ??üTCü | Duygu Sultan ORAN | Sezen SOLAK-KUMA? | Hüsniye Esra PA?AO?LU | Onat AKYOL | Kerem ERKALP | Evren ?NAY-U?AR
土耳其伊斯坦布尔大学研究生院科学研究所分子生物学与遗传学系
摘要
在神经发育过程中，反复或长期接触异氟烷（ISO）等全身麻醉剂可能导致长期的神经认知和行为缺陷，尤其是因为儿童大脑缺乏足够的抗氧化防御机制，而且目前尚无预防性疗法。迷迭香酸（RA）是一种具有抗氧化和神经保护作用的多酚化合物，但其缓解ISO诱导的毒性的效果尚未得到评估。在本研究中，Wistar白化大鼠幼崽在出生后第7、9和11天被暴露于异氟烷（浓度为1.5%，氧气/空气比例为30%）环境中，首次探讨了术前鼻内给予迷迭香酸（25 mg/kg，麻醉前1小时）的保护作用。对照组分别仅接受氧气处理或在氧气处理前接受迷迭香酸处理。在第12天，通过组织病理学和免疫印迹技术检测海马组织中的急性神经元凋亡、氧化应激、炎症及与应激相关的蛋白质。使用Morris水迷宫测试评估认知表现（包括空间学习能力，时间点为P28–P32）以及短期和长期记忆（P33、P60、P90）。反复接触异氟烷会损害学习能力和记忆，增加类似焦虑的行为，并导致海马损伤，同时上调促凋亡标志物（Bax/Bcl-2比值、切割的caspase-3、PARP1片段），引发氧化还原失衡和炎症（SOD1降低；GPX1、4HNE、NF-κB-p65升高）。异氟烷还通过降低p-HSF1、Hsp90和Hsp60的水平来干扰应激信号通路，同时上调Hsp70并下调14-3-3 isoforms。迷迭香酸预处理通过恢复抗氧化和应激反应相关蛋白、减轻炎症和凋亡、维持神经元完整性和认知功能来对抗这些效应。仅接受迷迭香酸处理的组未观察到有害作用。这些发现表明，鼻内给予迷迭香酸可能是一种预防儿童患者麻醉相关神经毒性的策略。
引言
尽管近年来麻醉技术和监测方法的进步提高了患者安全性并减少了麻醉相关并发症（Fu等人，2025年），但术后认知功能障碍仍然是神经损伤研究的热点领域。值得注意的是，对于三岁以下儿童的麻醉暴露仍存在担忧，因为这可能影响大脑发育并导致认知或行为问题（FDA，2017年）。虽然大规模临床研究（如GAS（Mccann等人，2019年）和PANDA（Sun等人，2016年）未发现单次短期暴露的不良反应，但MASK研究（Warner等人，2018年）指出多次暴露会增加学习和行为缺陷的风险。此外，动物研究表明，全身麻醉剂可通过诱导氧化应激、细胞死亡、炎症和突触功能障碍在早期发育过程中造成神经毒性（Niu等人，2022年）。
异氟烷（ISO）是临床实践中广泛使用的吸入麻醉剂。我们之前的研究（Demirgan等人，2021年；Y?lmaz等人，2023年；Karg?-Gemici等人，2024年）以及早期报告（Li等人，2019年；Maloney等人，2019年）表明，异氟烷会干扰海马发育，导致神经元丢失和认知缺陷。多项研究进一步指出，异氟烷暴露会加剧神经炎症反应、增加氧化应激、星形胶质细胞功能障碍，并激活中枢神经系统中的炎症和凋亡途径（Neag等人，2020年）。由于许多婴儿和幼儿在医疗过程中需要接受麻醉（Disma等人，2016年；Liu等人，2020年），这些潜在的不良反应凸显了开发有效神经保护策略的必要性。已有多种药理和天然化合物被研究用于减少异氟烷诱导的神经毒性，其中一些化合物在缓解行为缺陷和长期认知障碍方面显示出潜力（Bahadori等人，2025年）。这些研究的共同点是天然产物具有抗氧化特性，似乎能有效抵御异氟烷诱导的活性氧（ROS）。由于婴儿早期先天抗氧化防御机制不完善，补充抗氧化支持可能有助于保护发育中的大脑（Gascoigne等人，2022年）。然而，目前尚无临床验证的干预措施能预防长期认知效应，这凸显了需要更有效、易于实施的解决方案的迫切性。
迷迭香酸（RA；α-氧咖啡酰-3,4-二羟基苯乳酸）是一种天然存在于多种植物中的植物化学物质，尤其是唇形科植物中。作为一种天然物质，RA因其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用而受到重视，这些作用针对的是与神经退行性变相关的关键通路（Ravaria等人，2023年）。RA在不同实验模型中已被证明能有效减少认知缺陷，包括阿尔茨海默病（Mirza等人，2021年）、缺血引起的记忆丧失（Fonteles等人，2016年）、乙醇相关的认知障碍（Hasanein等人，2017年）以及胆碱能神经元损伤（Kantar Gok等人，2018年）。此外，它还显示出在神经炎症模型中抑制促炎反应（Wei等人，2018年）和减轻内质网（ER）应激介导的神经元损伤（Li等人，2025年）的作用。RA还能通过增加神经营养因子水平来支持突触可塑性和改善学习和记忆（Shi等人，2025年）。此外，在缺氧条件下，包括氧-葡萄糖剥夺引起的条件下，它对细胞存活和线粒体功能也有益处（Luo等人，2022年）。多项研究表明，RA能提高大鼠和小鼠的空间学习能力（Fonteles等人，2016年；Li等人，2025年）。因此，RA的多种抗氧化和神经保护作用使其成为减少麻醉诱导的神经毒性及保护发育中大脑的有希望的候选物质。
鼻内给药已成为一种将治疗药物直接输送到中枢神经系统的有前景的非侵入性方法。与传统给药途径（如口服或静脉注射）相比，鼻内给药能快速吸收药物，绕过首次通过肝脏的代谢过程，并通过嗅觉和三叉神经通路直接从鼻腔传递到大脑，从而部分穿越血脑屏障（Bicker等人，2020年；Qiu等人，2025年）。这些特点可以提高大脑生物利用度，同时减少全身暴露和周围副作用，使其特别适用于需要快速作用于中枢神经系统的神经保护策略（Gandhi等人，2024年；Koo等人，2024年）。此外，其非侵入性和临床可行性支持其作为神经治疗手段的潜力（Patel等人，2019年）。先前的一项研究表明，鼻内给予壳聚糖包覆的迷迭香酸纳米乳液可以增加大脑中的药物可用性，减轻神经炎症和氧化应激，并改善大鼠的记忆缺陷（Fachel等人，2020年）。因此，本研究选择鼻内给药方式来增强RA向大脑的传递。将RA纳入鼻喷雾制剂可能为治疗麻醉引起的损伤提供一种有效的治疗选择。
我们的研究首次展示了鼻内给予迷迭香酸对发育中大脑中异氟烷诱导的神经元损伤及随后的学习和记忆缺陷的潜在保护作用。在本研究中，Wistar白化大鼠幼崽在出生后第7、9和11天被暴露于异氟烷（浓度为1.5%，时间为3小时），这些时期与人类的神经发育关键时期相似。每次麻醉前1小时通过鼻内给予迷迭香酸（25 mg/kg）。迷迭香酸预处理保护了海马神经元免受凋亡、氧化应激和炎症的影响，还影响了热休克和14-3-3蛋白的水平，并减少了异氟烷引起的学习和记忆缺陷。这些发现表明，鼻内给予迷迭香酸可能是一种简单且创新的方法，有助于减轻儿童护理中全身麻醉的副作用。
本研究共使用了80只7天大的雄性Wistar白化大鼠（体重14-18克）。动物来自BADABEM（Ba?c?lar实验研究和技能发展培训中心）。繁殖在设施内采用三雄二雌的配对策略进行。交配后，怀孕的雌性被移至单独的产仔笼中，只有每窝有8-12只幼崽的窝才被纳入研究，以确保窝大小的一致性。
为了评估迷迭香酸对抗异氟烷诱导的学习缺陷的神经保护作用，进行了为期五天的MWM训练/习得阶段（图2A）。第一天，所有大鼠要么找不到隐藏的平台，要么找到平台的潜伏时间相似（P>0.05）。到第三天，异氟烷组的逃避潜伏时间显著长于对照组（P=0.0041）和RA+ISO组（P=0.0462），这一趋势持续到第四和第五天。第五天，异氟烷组的潜伏时间仍然显著更长。
大量文献记载，在早期发育阶段反复接触吸入麻醉剂会导致神经发育缺陷，主要通过凋亡、氧化应激和神经炎症等机制（Niu等人，2022年）。在突触发生的关键阶段，麻醉剂可能引发海马神经元的结构和功能紊乱，从而导致持续的损伤。
所有动物护理和实验均遵循ARRIVE指南和国家研究委员会关于实验室动物护理和使用的指南进行。本研究获得了伊斯坦布尔/Türkiye健康科学大学动物伦理委员会的批准（批准协议编号：2021/79，2021年5月3日）。本文不包含任何涉及人类参与者的研究。
本研究由土耳其伊斯坦布尔大学研究基金会资助 [资助编号FDK-2021-37893]。
作者声明没有利益冲突。
(Cornelius等人，2013年；FDA，2017年)
?nay-U?ar Evren：写作 – 审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。
Akyol Onat：实验设计。
Erkalp Kerem：写作 – 审稿与编辑、方法学。
Solak-Kuma? Sezen：实验设计。
Pa?ao?lu Hüsniye Esra：方法学、实验设计。
??ütcü ?rem：写作 – 初稿撰写、数据可视化、实验设计。
Oran Duygu Sultan：方法学、实验设计、数据管理。
?engelen Asl?han：写作 – 审稿与编辑。
作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
