《Talanta》：A Two-Dimensional Nanosheet-Enhanced Fluorescent Biosensor with Nucleic Acid Amplification for Breast Cancer-related miRNA Detection
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乳腺癌早期诊断中，基于催化发夹组装（CHA）与二维铜三嗪纳米片（[Cu(tz)]）的荧光传感系统，通过特异性吸附单链DNA实现荧光恢复，检测限达0.85 nM，显著提升灵敏度与操作简便性。
Xinyi Xia|Yuanchao Qi|Qingshan Chen|Huan Gong|Meixiang Yu|Xuemei Di|Jie Fan|Ping Yu|Xia Cheng|Hai Zhang
上海交通大学医学院附属上海第一妇产科医院母胎医学与妇科肿瘤学研究所，上海母胎医学重点实验室药学系，中国上海
摘要：
乳腺癌仍然是全球主要的健康负担，具有高发病率和死亡率，需要先进的诊断方法。虽然微小RNA（miRNAs）已成为有前景的生物标志物，但其临床应用面临一个重大障碍：缺乏可靠、便捷、超灵敏且高度特异的检测技术，从而无法实现准确诊断。为了解决这些问题，我们提出了一种创新策略，结合了催化发夹组装（CHA）技术和二维纳米片，用于miRNA生物标志物的检测，以实现精确的乳腺癌诊断（CHA-[Cu(tz)]系统）。该系统利用了二维铜(I) 1,2,4-三唑纳米片（[Cu(tz)]对单链DNA的选择性结合亲和力，通过CHA反应实现信号放大。在无目标miRNA的情况下，FAM标记的发夹DNA探针被吸附在[Cu(tz)]纳米片上，导致荧光共振能量转移（FRET）引起的荧光淬灭。当引入miRNA-21时，目标miRNA会触发CHA级联反应，生成大量的刚性双链DNA结构。这些双链结构对纳米片的亲和力很低，从而在等温条件下恢复荧光信号。荧光恢复与miRNA-21浓度在2–200 nM范围内呈强线性相关，检测限为0.85 nM，这一结果在血清样本中得到了进一步验证，并显示出优异的检测准确性。值得注意的是，该方法不仅克服了操作复杂和背景干扰高的问题，实现了从标准检测到放大检测的快速转换（35分钟内完成），还通过减少非特异性信号和简化工作流程显著提高了检测效率，为癌症研究和临床诊断提供了有价值的新工具。
引言
乳腺癌是一种起源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是全球女性中最常见的癌症[1]、[2]、[3]。2022年全球约有230万新病例（占所有女性癌症的23.8%）和67万人死亡（15.4%），使其成为女性癌症发病率和死亡率的主要原因[4]。预后高度依赖于疾病阶段，局部肿瘤的五年生存率超过99%，而远处转移的生存率仅为32%[5]、[6]、[7]、[8]。这凸显了早期诊断的重要性。尽管传统的成像方法（如乳腺X光摄影）有一定价值，但它们仅能在晚期识别癌症，并且使用电离辐射，存在致癌风险[9]、[10]、[11]、[12]。血清肿瘤标志物（碳水化合物抗原15-3和癌胚抗原）提供了一种非侵入性的筛查和监测方法，但其临床应用受到灵敏度和特异性的限制。因此，寻找更优秀的非侵入性生物标志物对于改善早期诊断和患者生存至关重要。
微小RNA（miRNAs）是内源性单链非编码RNA，通过与目标mRNA结合发挥关键的转录后调控作用[13]。它们在从胚胎发育到病毒感染和癌症发生等一系列生理和病理过程中起着关键作用[14]、[15]、[16]。miRNAs在癌症中的重要性在于，超过一半的miRNA基因位于脆弱的基因组区域，其失调会直接影响肿瘤的发生、进展和转移[17]。功能上，miRNAs可以作为致癌基因或肿瘤抑制因子。miRNA-21是一个典型的例子，它在乳腺癌、肝癌和肺癌等癌症中经常过表达[18]、[19]、[20]。miRNA-21的表达升高与肿瘤晚期、侵袭性增强和患者生存率降低密切相关，研究显示miRNA-21水平在癌症患者中显著升高，并与化疗耐药性和疾病进展相关[21]、[22]。除了组织分析外，miRNAs在血清和血浆等体液中也非常稳定，使其成为有前景的癌症检测非侵入性生物标志物[23]。因此，开发针对关键miRNAs（如miRNA-21）的侵入性、准确且低成本的检测方法对于提高诊断准确性、改善预后评估和指导个性化治疗策略具有巨大潜力[24]。
由于miRNAs长度短、丰度低以及家族成员之间序列同源性高，准确检测具有挑战性[25]。现有的miRNA-21检测技术，如Northern blotting、微阵列分析和定量逆转录PCR（qRT-PCR）存在显著的实际限制[26]、[27]。Northern blotting耗时且灵敏度不足，而微阵列尽管具有高通量能力，但特异性和重复性较差[28]、[29]。尽管qRT-PCR被视为金标准，但技术要求高，需要严格的样本处理，并且容易产生假阳性结果[30]。其他方法，包括电化学发光和表面等离子体共振，也有所探索，但许多传统检测方法存在工作流程复杂、分析时间长、灵敏度不足和特异性不够的问题[31]、[32]。在这种情况下，基于荧光的生物传感器因其操作简单、响应迅速和灵敏度高而成为有前景的替代方案。
由于临床样本中miRNA-21的丰度低，直接检测通常会产生微弱信号，因此核酸扩增对于提高灵敏度至关重要。尽管传统的扩增方法存在特异性和效率限制，但已经开发出一些无酶策略，如杂交链反应（HCR）和催化发夹组装（CHA）[33]、[34]。特别是CHA通过两个发夹探针（H1和H2）和催化剂（C1）之间的相互作用实现链置换。H1与C1结合后发生构象变化，暴露出一个新的结合位点，使其能够打开H2并形成稳定的H1/H2双链结构，同时回收C1进行多次催化循环。这一过程产生大量双链复合物，从而实现显著的信号放大。CHA具有高放大效率、优异的灵敏度、简单的操作方式和无酶的等温条件，非常适合生物传感[32]。
值得注意的是，纳米材料的集成显著提升了生物传感能力，使得平台具有更高的特异性、灵敏度和更简单的操作性。自石墨烯问世以来，二维（2D）纳米片（定义为单层或多层结构的原子级薄材料）在分析和电化学应用中得到了广泛应用[35]。一个突出的例子是二维铜(I) 1,2,4-三唑（[Cu(tz)]纳米片，通过Cu2+/1,2,4-三唑配位合成，具有高生物相容性、生物降解性和低细胞毒性[36]。这些纳米片已被用作基因沉默和光动力疗法中的DNA酶载体，刘等人在人类乳腺癌细胞中进行了验证[37]。此外，[Cu(tz)]纳米片作为传统有机淬剂（如BHQ1）的替代品，在基于核酸的检测中表现出良好的性能，由于具有高比表面积、强DNA吸附能力和宽吸收光谱，能够通过π–π堆叠相互作用吸附DNA。因此，将[Cu(tz)]等纳米材料与CHA等技术结合使用，为开发高灵敏度和广泛应用性的miRNA检测系统提供了可行的策略。
在这项工作中，我们将2D [Cu(tz)]纳米片与CHA扩增技术结合，开发了一种新型荧光生物传感器，用于高效和特异性地检测miRNA-21（CHA-[Cu(tz)]系统）。该系统使用5′端标记有荧光团（FAM）的发夹DNA探针。在无目标miRNA-21的情况下，探针被吸附在[Cu(tz)]纳米片上，导致FRET引起的荧光淬灭。当目标miRNA-21结合时，会触发CHA反应，生成大量的刚性Y形双链DNA结构。由于双链DNA在纳米片上的吸附力弱，FRET过程被抑制，从而在528 nm处恢复荧光。荧光强度随miRNA-21浓度的增加而增强，允许对其进行定量分析。这是首次尝试将CHA与[Cu(tz)]纳米片结合构建新的分析平台。该系统实现了从标准检测到放大检测的快速转换（35分钟内完成），克服了操作复杂性和高背景噪声的传统缺点，显著减少了非特异性信号，缩短了反应时间，简化了工作流程，提高了检测效率，最终扩展了癌症研究和临床诊断的分析能力。
材料与设备
实验中使用的材料、设备和DNA序列详见补充信息。
[Cu(tz)]纳米片的合成
首先将25 mg的CuSO4·5H2O和88 mg的抗坏血酸（AA）溶解在50 mL的超纯水中，合成Cu2O纳米颗粒。加入1 g的NaOH并搅拌后，溶液立即变为橙色。在室温下搅拌5分钟后，通过离心（10,000 rpm，10分钟）收集产物，用超纯水洗涤四次，然后重新悬浮在5
CHA-[Cu(tz)]系统用于miRNA-21的工作原理
如图1A所示，CHA-[Cu(tz)]系统的核心设计结合了二维[Cu(tz)]纳米片对单链（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）的不同亲和力，以及三发夹CHA电路的信号放大功能。无放大情况下的基本机制如图1B所示。发夹DNA探针（H1）经过巧妙设计，具有目标识别区域，并在5′端标记有FAM荧光团。
结论
总结来说，我们开发了一种敏感且选择性的CHA-[Cu(tz)]系统，通过将二维[Cu(tz)]纳米片与CHA信号放大策略相结合，实现了肿瘤生物标志物miRNA-21的定量检测。该传感机制基于[Cu(tz)]纳米片对单链和双链DNA的不同亲和力。在无目标miRNA的情况下，FAM标记的发夹探针被吸附在纳米片上，导致高效的荧光
CRediT作者贡献声明
Xia Cheng：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。Hai Zhang：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。Ping Yu：撰写 – 审稿与编辑，监督。Yuanchao Qi：可视化，方法学，研究。Qingshan Chen：可视化，验证，研究。Xinyi Xia：撰写 – 原稿撰写，方法学，概念构思。Xuemei Di：资源提供。Jie Fan：资源提供。Huan Gong：数据管理。Meixiang Yu：验证
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：62305207和82204349）、吴洁平医学基金会（资助编号：32067502024-18-15）、上海青年 pharmaceutical 人才能力提升计划（资助编号：SPAQNRC2025A15）、国家青年医学创新研究项目（资助编号：P250530109214和P250320108852）以及瑞金医院的精英创新研究项目（资助编号：JYCY-2025-002和JYCY-2025-015）的支持。
