《Talanta》：Single-cell ICP-MS for assessing genetic modifications affecting intracellular phosphorus levels and polyphosphate nanoparticle formation in
Streptomyces coelicolor
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本研究优化单细胞电感耦合等离子体质谱法（sc-ICP-MS）检测链霉菌二氧化碳中磷含量，证实突变株sco1897::Tn5孢子磷含量是野生型的两倍（p<0.001），并首次通过电镜和共聚焦成像确认多聚磷酸颗粒（volutins）的存在，为磷代谢个体化研究提供新方法。
Paula García-Cancela | Gemma Fernández-García | ángel Manteca | J?rg Bettmer | María Montes-Bayón
奥维耶多大学化学系物理与分析化学系，Julián Clavería 8号，E-33006，西班牙奥维耶多
摘要
磷是细菌代谢中的一种必需元素，在模式放线菌Streptomyces coelicolor中作为初级和次级代谢过程的关键调节因子。在这项研究中，我们利用单细胞电感耦合等离子体质谱（sc-ICP-MS）技术来检测单个孢子中的磷含量。该菌株（sco1897::Tn5）经过基因改造，已知与磷酸盐稳态有关，并且会对次级代谢产生多效性影响。通过适当的样品清洗程序，使用三重四极杆ICP-MS（能够测量PO+）可以有效减少多原子干扰和背景信号，从而实现1 μm细菌中磷的单个事件的准确检测。测试了不同的驻留时间（100 μs–5 ms），发现较短的驻留时间显著提高了检测限（100 μs时达到0.6 fg spore-1，比5 ms时降低了八倍），并减少了变异。结果表明，突变菌株的每个孢子中的磷含量是野生型的两倍（分别为12 fg P/spore和4 fg P/spore，p<0.001，以5 ms为例），这证实了< />区域在磷酸盐调节中的作用。首次应用色谱分离孢子裂解液后进行单粒子ICP-MS分析，以确定Streptomyces coelicolor中是否存在与多聚磷酸盐颗粒（volutins）一致的颗粒状磷。这些直径小于100 nm的纳米颗粒通过透射电子显微镜和DAPI染色后的共聚焦成像得到确认，显示出与多聚磷酸盐相关的特征绿色荧光。总体而言，本研究为放线菌中磷的单细胞和纳米颗粒水平定量提供了一种方法学框架，将基因调控与元素组成和生物纳米颗粒形成联系起来。
引言
链霉菌是放线菌门中数量最多的细菌属。在这些革兰氏阳性细菌中，Streptomyces coelicolor因其形态发育和产生用于临床实践的天然化合物（如抗生素、抗癌剂或免疫抑制剂）而被广泛研究[1]，[2]。
Streptomyces coelicolor具有复杂的生活周期，包括单细胞阶段（如萌发或孢子形成）和多细胞丝状阶段（如营养菌丝或气生菌丝）。当孢子处于适宜条件下时，周期从形成萌发管开始，随后生长和分枝，最终形成休眠孢子，这种孢子会在环境条件再次适宜时才被激活[3]，[4]，[5]。这种长期休眠能力和丝状生长特性使其能够在缺乏水分的土壤环境中生存，并到达其他营养区域，同时提供更大的吸收表面。此外，不断变化的环境和刺激要求细菌与其周围环境相互作用，能够吸附或整合介质中的不同元素[6]，从而影响其代谢[7]，[8]。例如，在含有铜的培养基中，Streptomyces coelicolor会积累铜，形成细胞内生物纳米颗粒作为潜在的解毒方式[9]。其他此类细菌生物合成的例子包括Staphylococcus epidermidis产生的金纳米颗粒[10]、Cupriadivus sp.产生的银纳米颗粒[11]或Bacillus sp.产生的硒纳米颗粒[12]。
其他元素，如碳、氮或磷，在细菌代谢中也起着重要作用。碳是所有有机分子（包括碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸）的结构基础。氮存在于氨基酸、核酸、蛋白质和肽聚糖中。在这两种情况下，它们对次级代谢的影响主要取决于环境中碳（葡萄糖、甘油、甘露醇）或氮（铵、硝酸盐、氨基酸）的来源及其可用性[13]，[14]，[15]，[16]。
就磷而言，特别是以磷酸盐形式存在的磷，它存在于许多生物分子中，如核酸、磷脂、ATP/GTP（三磷酸腺苷/三磷酸鸟苷）和多聚磷酸盐，并被认为是代谢反应的全球调节因子。在磷酸盐受限的情况下，转录调节因子PhoP被激活，增加环境磷酸盐的运输并降解细胞质中的多聚磷酸盐，进而抑制孢子形成并调节多种次级代谢途径[17]，[18]，[19]，[20]。PhoP还与氮的转录调节因子（如GlnR）和碳的转录调节因子（如DasR）相互作用，三者之间协同调节次级代谢[21]，[22]。
在某些细菌中，如电缆细菌[23]、多种分枝杆菌[24]、Agrobacterium tumefaciens[25]、Corynebacterium glutamicum[26]、Acetonema longum[27]或Synechococcus sp.[28]中，发现磷以多聚磷酸盐颗粒的形式存在，这些颗粒也被称为volutins[29]。它们由数十到数百个磷残基通过高能磷酰酐键和二价阳离子连接而成[30]。这些颗粒被认为参与细胞膜形成、转录和酶调控、应激反应以及阳离子隔离[31]，尽管它们的主要功能是作为能量储存库[32]，[33]。
传统上，细胞中磷的定量是通过其与钼蓝的反应进行分光光度法测定的[34]。这种方法存在一些限制，并且会受到复杂基质的干扰。在这方面，当使用三重四极杆质谱仪时，电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）为磷的测定提供了良好的替代方案。利用氧气作为反应气体，磷的质量从m/z 31跃迁到m/z 47（通过形成PO+），可以提高检测灵敏度并显著减少光谱干扰。对于单个细胞的分析，这种方法已成功应用于酵母细胞（特别是Saccharomyces cerevisiae，大小为5-7 μm）中的磷检测[35]，[36]，[37]，[38]，但尚未应用于更小的生物体，如Streptomyces coelicolor细菌（0.8-1.2 μm）[35]，[36]，[37]，[38]。
在之前的一篇文章[39]中，通过将Tn5转座子插入< />基因中，证实了该突变体影响了从< />基因到< />基因的遗传区域的正常功能。这一区域与细胞水平的磷稳态变化有关。在这项工作中，我们优化了样品制备和单个孢子中磷的检测方法，以探索将其作为未来研究Streptomyces及一般细菌中单细胞水平磷代谢的工具的可能性。因此，将优化单细胞ICP-MS的磷检测方法，并量化两种受磷稳态影响的菌株中的磷含量，以研究基因改造对该元素的影响。研究的菌株包括在< />基因中突变的< />菌株和作为对照的野生型菌株。为了全面了解它们的磷含量，还将通过补充技术研究多聚磷酸盐颗粒的存在情况。
材料与方法
所有溶液均使用来自ELGA（High Wycombe，英国）PURELAB flex 3系统的超纯水制备。外部校准使用Sigma-Aldrich（Saint Louis，密苏里州，美国）提供的磷ICP-MS标准品TraceCERT?（1000 mg L-1）进行。
细菌菌株和培养条件
使用了两种Streptomyces coelicolor M145菌株及其< />基因的突变体（< />）[39]。
Streptomyces coelicolor孢子在SFM培养基（大豆粉和甘露醇）[40]固体平板上培养
单个孢子中总磷含量的测定
先前已有研究利用scICP-MS分析细菌中的元素含量。这种应用的主要优势在于细菌细胞体积小（< 5 nm），并且具有坚固的细胞壁，从而在传输到等离子体过程中最小化细胞破坏。因此，这类分析物的传输效率可达70-80%[44]。ICP-MS分析前需要准备细菌孢子
结论
本研究证明，单细胞电感耦合等离子体质谱（sc-ICP-MS）与三重四极杆技术的结合以及适当的样品清洗协议，为Streptomyces coelicolor单个孢子中磷的精确定量提供了强大而可靠的工具。优化分析条件有效减少了光谱和基质干扰，确保了单个细胞的准确检测。
CRediT作者贡献声明
Maria Montes-Bayon：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、资源管理、项目管理、方法学。
Paula García-Cancela：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、实验研究、数据分析。
Gemma Fernández-García：初稿撰写、方法学研究、数据分析。
ángel Manteca：初稿撰写、监督、方法学研究、概念构建。
J?rg Bettmer：撰写 – 审稿与编辑、方法学研究、资金支持。
利益冲突声明
所有作者声明与本研究无关的商业或财务利益。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文工作的商业或个人利益关系。
致谢
作者感谢西班牙MCIU（西班牙科学、创新和大学部，资助编号PID2021-123854OBI00和MCINN-23-PID2022-137222OB-I00）以及Principado de Asturias/Sekuens（资助编号：IDE/2024/000742）的财政支持。ángel Manteca实验室的工作得到了“Ministerio de Ciencia, Innovación, Universidades / Agencia Estatal de Investigación / Fondo Europeo de Desarrollo Regional”（PID2021-122911OB-I00）的资助
