《SCIENCE ADVANCES》：One-component ionizable amphiphilic Janus dendrimers as a delivery platform for efficient mRNA vaccine development
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为解决当前四组分LNP（脂质纳米颗粒）mRNA递送系统存在的稳定性、毒性、合成复杂性等问题，研究人员开发了一种新型的自组装单组分离子化两亲性Janus树状大分子（IAJD）递送平台。研究表明，该平台可高效、靶向地将mRNA递送至脾脏和淋巴结，并在4°C下保持长期稳定性，且在小鼠模型中诱导出强大而持久的诺如病毒特异性体液与细胞免疫应答。该工作为开发更稳定、更安全、更易大规模生产的下一代mRNA疫苗提供了新策略。
2019年，一种名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的病原体引发了全球大流行，也极大地推动了核苷修饰信使核糖核酸（messenger RNA, mRNA）疫苗技术的快速发展。这种疫苗技术能在短时间内编码病原体的关键抗原蛋白，诱导机体产生保护性免疫反应，展现出快速、灵活应对新发传染病的巨大潜力。然而，脆弱的mRNA分子极易在体内被降解，其成功应用高度依赖于一个高效的递送系统，将mRNA安全、完整地送入靶细胞。目前，以辉瑞/BioNTech和莫德纳（Moderna）的COVID-19疫苗为代表的商业化mRNA疫苗，普遍采用四组分脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP）作为递送载体。它像一辆“装甲车”，保护mRNA穿越重重障碍。但这辆“车”的结构相当复杂，由可离子化脂质、胆固醇、辅助磷脂和聚乙二醇（PEG）化脂质四种成分精密装配而成。这种复杂性带来了诸多挑战：合成步骤繁琐、规模化生产难度大、长期储存（特别是常规冷藏条件）稳定性不足，并且其组分（如PEG和胆固醇）可能引发不良反应。这些限制犹如一道道“枷锁”，阻碍了mRNA疫苗在全球，尤其是在冷链设施薄弱地区的可及性与公平分配。
为了打破这些“枷锁”，科学家们一直在寻找更简单、更稳定、更安全的递送方案。本研究应运而生，报道了一种革命性的递送平台——单组分离子化两亲性Janus树状大分子（Ionizable Amphiphilic Janus Dendrimer, IAJD）。与需要四种原料“拼装”的LNP不同，IAJD是一种结构精确设计的单一分子，其自身就能与mRNA通过简单的一步混合过程，共同组装成均匀的纳米颗粒，称为树状大分子体（dendrimersome）。这就像是用一种“智能积木”直接搭成了坚固的“运输舱”，极大地简化了制造流程。研究人员以诺如病毒（Norovirus）衣壳蛋白mRNA为模型抗原，深入评估了其中一种名为IAJD97的候选分子的递送效率、稳定性和免疫原性，旨在证明这种单组分平台能否成为下一代mRNA疫苗研发的利器。
本研究综合运用了多种关键技术方法。在材料制备方面，合成了IAJD97并通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）等技术进行了表征；通过一步混合法将IAJD97与荧光素酶（Luc）或诺如病毒衣壳蛋白（VP1）的mRNA进行共组装，形成纳米颗粒，并利用动态光散射（DLS）测量粒径和多分散指数（PDI），利用Quant-iT RiboGreen RNA试剂盒测定包封率，利用TNS荧光探针法测定表面pKa。在动物实验方面，使用6-8周龄的BALB/c小鼠，通过静脉或肌肉注射给予mRNA-IAJD97制剂，利用活体成像系统（IVIS）动态监测荧光素酶蛋白的表达与分布，以评估递送靶向性和动力学。在免疫效果评价方面，通过基于病毒样颗粒（VLP）的配体结合阻断实验（即替代中和试验）检测血清中和抗体（nAb）滴度；通过多色流式细胞术分析脾脏抗原特异性CD4+和CD8+T细胞的细胞因子（IFN-γ, TNF-α, IL-2）表达，以及引流淋巴结中滤泡辅助性T细胞（TFH）和生发中心B细胞（GC B cell）的比例，以评估细胞免疫应答。在安全性评价方面，对主要器官进行组织病理学（H&E染色）检查，并检测血清中的肝酶（ALT, AST）水平。
IAJD97介导的Luc mRNA向淋巴器官的靶向递送
研究人员从超过300种IAJD分子库中筛选出IAJD97，因其能特异性靶向脾脏和淋巴结。将荧光素酶mRNA与IAJD97共组装后静脉注射小鼠，活体成像显示，注射后4小时，脾脏的荧光素酶蛋白表达信号比其他主要器官（如心、肺、肝）高出数个数量级，证实了IAJD97对脾脏的高效靶向性。纳米颗粒表征显示其粒径均一、包封率高、表面pKa适宜，冷冻透射电镜图像揭示了其具有多层“洋葱状”结构。
荧光素酶蛋白表达在mRNA-IAJD97静脉注射后持续至少96小时
动力学研究表明，静脉注射后，全身的荧光素酶活性在24小时时仍保持初始信号的45%，在脾脏和淋巴结中的表达可持续检测至96小时，显示了IAJD97递送系统能够支持较长时间的蛋白表达。
Luc mRNA-IAJD97制剂在+4°C下至少稳定26周
稳定性测试是本研究的一大亮点。将制备好的mRNA-IAJD97纳米颗粒储存在4°C冰箱中，定期取样注射小鼠。结果表明，无论是储存在醋酸缓冲液还是磷酸盐缓冲液中，制剂在26周内仍能保持高效的荧光素酶活性。甚至在储存40周后，仍可检测到明显的生物发光信号。相比之下，在相同储存条件下，采用传统四组分LNP（SM102）包裹的mRNA则出现了显著降解。这证明了IAJD97平台具有卓越的冷藏稳定性，有望缓解对超低温冷链的依赖。
Luc mRNA-IAJD97制剂递送缺乏毒性
安全性评估显示，即使以较高剂量（10 μg和30 μg mRNA/只）静脉注射，小鼠的主要器官（心、肺、肝、肾）未出现炎症或病理结构改变，血清ALT和AST水平也无显著变化。仅在30 μg高剂量组的脾脏中观察到轻度、可逆的免疫细胞变化，表明该制剂在有效剂量下具有良好安全性。
诺如病毒VP1 mRNA-IAJD97疫苗引发强效且持久的体液免疫应答
用编码诺如病毒衣壳蛋白的mRNA与IAJD97制成的疫苗免疫小鼠。结果表明，低至1 μg的mRNA剂量即可诱导高滴度的中和抗体。更重要的是，其诱导的中和抗体水平与采用临床验证的四组分LNP（SM102）制备的疫苗相当。通过肌肉注射免疫，所产生的中和抗体应答可持续至少150天，展现了持久的免疫保护潜力。
诺如病毒VP1 mRNA-IAJD97疫苗引发强烈的细胞免疫应答
疫苗不仅能激发抗体，还能调动关键的T细胞。流式细胞术分析显示，该疫苗能诱导抗原特异性的、多功能的CD4+和CD8+T细胞，这些细胞大量产生干扰素-γ、白介素-2和肿瘤坏死因子-α等1型免疫相关细胞因子。同时，疫苗还能在引流淋巴结中有效激活滤泡辅助性T细胞和生发中心B细胞，这两类细胞对于产生高质量、长寿命的抗体至关重要。
综上所述，本研究成功开发并验证了一种基于单组分离子化两亲性Janus树状大分子（IAJD97）的新型mRNA递送平台。该平台通过简单的自组装过程，实现了对mRNA的高效包封和靶向递送，尤其擅长将mRNA运送至免疫激活的关键场所——脾脏和淋巴结。与当前主流的四组分LNP相比，IAJD97平台具有多重显著优势：其一，成分与工艺极大简化，单一组分避免了复杂配方和微流控设备，降低了生产成本和工艺门槛；其二，稳定性突出，制剂在常规4°C冷藏条件下可长期（至少26周）保持mRNA完整性和生物活性，突破了现有mRNA疫苗对深度冷链的严苛要求；其三，安全性良好，在实验剂量下未发现明显的系统毒性，且不含可能引起过敏反应的PEG成分；其四，免疫原性强效，在诺如病毒模型上，其诱导的体液和细胞免疫应答的强度与持久性，均可与成熟的四组分LNP平台相媲美。
这项研究的发现具有重要意义。它不仅为mRNA疫苗，也为更广泛的核酸药物（如小干扰RNA、环状RNA、质粒DNA）递送提供了一个极具前景的新平台。其简化、稳定、高效、安全的特点，特别有利于解决中低收入国家在疫苗可及性、储存和分发方面面临的现实挑战，为应对未来可能出现的流行病提供了更具韧性的技术方案。该成果以《单一组分离子化两亲性Janus树状大分子作为高效mRNA疫苗研发的递送平台》为题，发表在《科学·进展》（Science Advances）期刊上，为下一代疫苗技术的发展开辟了一条新路径。
