《SCIENCE ADVANCES》：Targeted intracellular oral RNA delivery through tea polyphenol nanovesicle to outer membrane vesicle transfer for colitis treatment
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本研究针对核酸疗法中RNA口服递送效率低、稳定性差的难题，创新性地提出一种囊泡-囊泡转导策略，通过特异性酰化的表没食子儿茶素（EGC palmitate）高效自组装包载siRNA形成纳米囊泡（sEPVs），并利用简单超声操作将其与源自益生菌EcN的外膜囊泡（OMVs）膜融合，构建了杂化囊泡（HVs）。该杂化囊泡进一步锚定HA-BR-KDEL配体，实现了对炎症细胞（通过HA靶向CD44受体）及内质网（通过KDEL肽）的序贯靶向。口服递送HVs@HA-BR-KDEL显著缓解了DSS诱导的小鼠结肠炎症状，并有助于恢复肠道稳态。该策略为口服基因介导的治疗提供了极具前景的平台。
治疗肠道疾病，吃药打针是常规操作，但若想把像“基因剪刀”一样的核酸药物（如siRNA）精准地送到肠道病灶处，通过口服来实现，那可就是一件极具挑战的事情了。这是因为，口服的药物需要闯过消化道内强酸、强酶的重重关卡，药物本身极易被降解；即便侥幸存活，如何精准地粘附并进入发炎的肠道细胞内部发挥作用，也是拦在科学家面前的大山。因此，开发一种能够保护核酸药物、并能聪明地找到并进入病灶细胞的“口服快递”系统，成为了生物医药领域亟待突破的难题。
就在这样的背景下，一项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究带来了令人振奋的解决方案。研究者们巧妙地从大自然中寻找灵感，设计了一套“囊泡接力”式的智能递送系统，成功将治疗性siRNA口服递送至发炎的肠道细胞内部，并在小鼠模型中显著改善了结肠炎。
为了构建这套系统，研究者们运用了几个关键的技术方法。首先，他们通过选择性酰化修饰茶多酚的主要成分之一——表没食子儿茶素（EGC），合成了具有两亲性的EGC棕榈酸酯。该分子可高效地自组装并包载靶向肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的小干扰RNA（siRNA），形成siRNA-EGC棕榈酸酯囊泡（sEPVs）。其次，他们从益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN）中分离了天然的外膜囊泡（OMVs）。接着，通过简单的超声处理，诱导sEPVs与OMVs发生膜融合，形成了结合二者优势的杂化囊泡（HVs）。最后，他们将一种由透明质酸（HA）、胆红素（BR）和KDEL肽构成的靶向配体（HA-BR-KDEL）锚定在杂化囊泡表面，构建了最终的治疗平台HVs@HA-BR-KDEL。在动物实验中，他们使用了葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型来评估疗效。
研究结果
Specific acylation of EGC
研究人员成功对EGC进行了特异性酰化修饰，合成了EGC棕榈酸酯。该修饰在赋予分子两亲性和自组装能力的同时，最大限度地保留了其酚羟基，从而维持了与RNA的结合能力和抗氧化活性。核磁共振（NMR）和高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）分析证实了产物的高纯度和正确结构。
Preparation and characterization of HVs
研究证明，EGC棕榈酸酯能与TNF-α siRNA高效自组装形成sEPVs，最佳包载效率达85%。透射电镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）显示sEPVs和从EcN中分离的OMVs均呈球形，粒径分别约为156纳米和175纳米。通过超声融合sEPVs和OMVs，成功构建了杂化囊泡（HVs），其粒径略有增加，zeta电位显著降低。荧光共振能量转移（FRET）和共聚焦显微镜（CLSM）成像结果均证实了sEPVs与OMVs之间发生了高效的膜融合。形成的HVs对siRNA的包载效率（67%）显著高于直接将siRNA载入OMVs的效率（27%）。
Stability of siRNA in nanovesicles in vitro
稳定性测试表明，HVs和sEPVs均能有效保护包载的siRNA免受核糖核酸酶（RNase）的降解。在模拟胃液（SGF）中孵育2小时后，HVs的保护作用显著优于sEPVs，这归功于OMVs膜提供的额外屏障，表明HVs能更好地适应复杂的胃肠道环境。
Preparation of HVs@HA-BR-KDEL
研究人员成功合成了HA-BR-KDEL配体，并通过疏水相互作用将其锚定在HVs膜上，形成了最终的靶向递送系统HVs@HA-BR-KDEL。CLSM成像显示了配体与囊泡的成功结合。
Cellular uptake of HVs@HA-BR-KDEL
在脂多糖（LPS）刺激的炎症RAW264.7巨噬细胞（高表达CD44）中，HVs@HA-BR-KDEL展现了最强的细胞摄取效率，这主要归功于HA与CD44受体的特异性结合。内吞途径抑制实验表明，其进入细胞主要依赖于网格蛋白介导的内吞作用（占79.9%）。更重要的是，CLSM分析显示，携带KDEL肽的HVs@HA-BR-KDEL能有效地将siRNA递送至细胞的内质网（ER），实现了细胞内细胞器的精准靶向。
ROS scavenging and anti-inflammatory activity in vitro
在LPS诱导的炎症细胞模型中，HVs@HA-BR-KDEL表现出最强的活性氧（ROS）清除能力，并能最有效地抑制一氧化氮（NO）和促炎细胞因子（TNF-α， IL-6）的分泌，同时提升抗炎因子IL-10的水平。此外，它还能显著抑制内质网应激标志物CHOP和GRP78的表达。细胞活性实验证实了该系统良好的生物相容性。
Safety and biodistribution of HVs@HA-BR-KDEL in vivo
小鼠口服毒性实验显示，HVs@HA-BR-KDEL在主要器官和胃肠道中均未引起明显的组织损伤或炎症，血液生化指标正常，证明了其良好的体内生物安全性。近红外荧光（NIRF）成像显示，在DSS诱导的轻度结肠炎小鼠模型中，口服给药24小时后，DiR标记的HVs@HA-BR-KDEL能特异性并持久地富集在发炎的肠道组织，且与炎症标志物CD11b阳性的细胞共定位，而在健康小鼠或使用非靶向HVs的模型鼠中积累很少。重要的是，荧光信号仅局限于胃肠道，未在其他主要器官中检测到，表明系统吸收极少。
Therapeutic efficacy of HVs@HA-BR-KDEL against colitis in mice
在急性DSS结肠炎小鼠模型中，口服HVs@HA-BR-KDEL（siRNA剂量200微克/千克）治疗5天，显示出卓越的治疗效果。与模型组或其他治疗组（sEPVs, siRNA-OMVs, HVs）相比，HVs@HA-BR-KDEL治疗组小鼠体重恢复最快，疾病活动指数（DAI）显著降低，结肠长度缩短得到明显抑制，脾脏系数（反映系统炎症）显著下降。组织病理学（H&E染色）显示其能最有效地修复结肠黏膜结构，减少炎症细胞浸润和溃疡，并增加杯状细胞数量。髓过氧化物酶（MPO）染色证实了中性粒细胞浸润的减少。免疫荧光显示，治疗恢复了紧密连接蛋白（ZO-1和Occludin）的表达。此外，治疗还显著降低了结肠组织中的ROS水平，并有效敲低了TNF-α的mRNA表达。剂量效应研究表明，该疗法在50-600微克/千克的siRNA剂量范围内均有效，并确定了相关效应的半数有效浓度（EC50）或半数抑制浓度（IC50）。
Effects of HVs@HA-BR-KDEL on the gut microbiota
通过对小鼠粪便进行16S rRNA基因测序分析发现，HVs@HA-BR-KDEL治疗能显著增加结肠炎小鼠肠道菌群的α多样性，并使菌群结构（β多样性）更接近于健康小鼠。具体表现为，治疗恢复了有益菌科Anaerovoracaceae以及有益菌属如Anaerotruncus、Streptococcus和Ruminococcus的丰度，同时抑制了与疾病相关的Escherichia-Shigella等菌属的增殖。
研究结论与意义
该研究成功建立了一种高效的口服siRNA递送新策略。其核心在于利用特异性酰化的茶多酚EGC直接包载siRNA形成纳米囊泡，再通过简单的膜融合技术，将其与益生菌EcN来源的OMVs结合，构建出兼具良好胃肠道稳定性、炎症靶向性和生物活性的杂化囊泡平台。进一步功能化修饰的HA-BR-KDEL配体，则赋予了该平台对炎症细胞及其内质网的序贯主动靶向能力。
体内外实验充分证明，口服递送的HVs@HA-BR-KDEL能高效靶向并富集于发炎的结肠组织，被炎症细胞摄取，并将siRNA精准递送至胞内内质网，从而有效沉默关键促炎因子TNF-α的表达。同时，系统组分EGC棕榈酸酯和BR的抗氧化作用协同减轻了氧化应激。这些效应共同导致了结肠炎症的显著缓解、黏膜屏障的有效修复以及肠道菌群紊乱的改善，最终实现了对结肠炎的综合治疗。
该研究的重大意义在于：第一，开创了“囊泡-囊泡”转导的RNA递送新思路，简化了制备流程，提高了包载效率；第二，巧妙融合了天然茶多酚和益生菌OMVs的各自优势，构建了一个生物相容性好、功能协同的智能递送系统；第三，通过序贯靶向设计，实现了从组织到细胞再到细胞器的精准药物递送，极大提升了治疗的特异性和有效性。这项工作不仅为炎症性肠病（IBD）的口服基因治疗提供了一种极具前景的新方案，其构建策略和平台也有望扩展应用于其他胃肠道疾病乃至全身性疾病的核酸药物递送，具有重要的临床转化潜力。
