《SCIENCE ADVANCES》：A small-molecule stabilizer of the calpastatin–calpain-2 complex restores mitochondrial function and mitigates neurodegeneration
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本研究针对神经退行性疾病中CAST下调导致的calpain-2过度激活、线粒体功能障碍和蛋白异常聚集等核心问题，研究人员通过药物化学优化，开发了可透过血脑屏障的小分子PPI稳定剂A36。该分子可选择性稳定CAST–calpain-2蛋白互作，增强CAST水平，抑制病理性的calpain-2激活，进而恢复线粒体功能、减少致病蛋白聚集，在HD和tauopathy小鼠模型中展现出神经保护作用。这为靶向蛋白水解失衡和线粒体损伤的治疗策略提供了新思路。
神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病，以及本研究所关注的亨廷顿病（Huntington's disease, HD）和tau蛋白病，是困扰全球老龄化社会的重大健康挑战。这些疾病虽然临床表现各异，但在细胞和分子层面却共享着一些关键的病理“交汇点”，其中，线粒体功能障碍和蛋白水解（proteolysis）系统失调被认为是两大核心驱动因素。线粒体作为细胞的“能量工厂”，其功能紊乱会导致能量危机、活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生；而蛋白水解系统的失控，则会导致细胞内重要的功能性蛋白被错误切割、降解，或使错误折叠的致病蛋白（如突变亨廷顿蛋白mutant huntingtin, mtHtt；磷酸化tau蛋白phosphorylated tau）大量累积。这两条通路相互交织，形成恶性循环，最终导致神经元死亡。在众多蛋白酶中，钙蛋白酶-2（calpain-2）——一种钙离子（Ca2+）激活的半胱氨酸蛋白酶——的病理性强激活，被发现在多种神经退行性疾病中扮演了“破坏者”的角色。它像一个失控的分子剪刀，不仅切割神经元骨架、突触相关蛋白，还通过激活线粒体分裂蛋白Drp1（Dynamin-related protein 1）导致线粒体过度碎片化，并直接参与生成tau、α-突触核蛋白、mtHtt等致病蛋白的毒性片段，加剧疾病进程。
然而，直接靶向并抑制calpain-2的活性却是一条充满荆棘的治疗之路。传统的广谱calpain抑制剂在临床试验中屡屡受挫，原因在于其缺乏亚型（isoform）选择性，在抑制有害的calpain-2同时，也影响了执行重要生理功能（如突触可塑性）的calpain-1，且常伴随脱靶毒性。那么，有没有一种更精准、更符合生理调控逻辑的策略呢？答案是肯定的。细胞自身配备了一个天然的“刹车”系统——钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin, CAST）。CAST是calpain的内源性、特异性抑制剂，它能与calpain结合并抑制其活性。在疾病状态下，CAST水平常常下调，导致对calpain-2的抑制解除，从而引发一系列病理级联反应。有趣的是，在临床前模型中，通过基因手段上调CAST水平，能够在不干扰calpain生理功能的前提下，有效抑制calpain-2驱动的病理过程，展现出良好的神经保护效果。这提示我们，药理性地“稳定”或“增强”CAST的功能，可能是一条比直接“抑制”calpain更具前景的治疗新途径。
在此背景下，发表于《SCIENCE ADVANCES》的这项研究应运而生。研究人员从一个已知的糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3, GSK3）抑制剂CHIR99021出发，该分子此前被意外发现具有独立于GSK3抑制之外的、通过稳定CAST来增强线粒体功能和保护神经元的作用。但CHIR99021本身的GSK3抑制活性可能带来脱靶效应，限制了其转化潜力。于是，研究团队开展了一项聚焦的药物化学（medicinal chemistry）优化工作，目标明确：改造CHIR99021，得到一类能保留甚至增强其CAST稳定和线粒体保护活性，但同时完全消除GSK3抑制作用的化合物。经过系统的结构-活性关系（structure-activity relationship, SAR）分析和多轮筛选，一个名为A36（原代号化合物82）的小分子脱颖而出。
为了系统验证A36的作用并阐明其机制，研究人员综合运用了多项关键技术。在分子和细胞机制探索上，采用了药物亲和反应靶点稳定性（drug affinity responsive target stability, DARTS） 结合液相色谱-串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry, LC-MS/MS） 来寻找A36的直接作用靶点；利用亲和选择质谱（affinity selection mass spectrometry, ASMS） 精确分析A36对CAST、calpain-1、calpain-2及其复合体的选择性结合。在功能验证上，使用了短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）敲低技术在细胞模型中确认CAST、calpain-2对A36活性的必要性。在疾病模型构建上，研究使用了患者来源诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）分化的神经元（来自亨廷顿病患者）作为高度相关的人源细胞模型；在体研究则采用了两种经典转基因小鼠模型：模拟亨廷顿病的R6/2小鼠和模拟tau蛋白病的PS19小鼠。此外，细胞热转移分析（cellular thermal shift assay, CETSA） 用于确认化合物对GSK3β的结合，MDR1-MDCK细胞模型用于评估血脑屏障渗透性，海马分析仪（Seahorse analyzer） 用于测量线粒体耗氧率（oxygen consumption rate, OCR），多种行为学测试（如旷场、Barnes迷宫、Y迷宫）用于评估动物模型的运动与认知功能。
研究发现A36，一种CAST稳定剂，具有线粒体保护活性
通过药物化学优化，研究人员从CHIR99021类似物中筛选出化合物A36。在亨廷顿病模型HdhQ111纹状体神经元中，A36能剂量依赖性地提升线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）、增强细胞活力，其半数有效浓度（EC50）分别约为2.77 μM和1.55 μM。重要的是，A36在激酶分析和CETSA中均不抑制GSK3β，且其MDR1-MDCK外排比低（0.868），预示着良好的中枢神经系统渗透性。Western blot结果显示，A36能剂量依赖性地提升CAST蛋白水平（EC50~3.55 μM），而不影响其mRNA水平，表明它通过翻译后机制稳定CAST。
A36治疗可恢复HD神经元细胞的线粒体功能和CAST表达
在HdhQ111细胞中，A36治疗能剂量依赖性地降低线粒体ROS、增强线粒体呼吸（包括ATP产量和最大呼吸能力），并改善因疾病导致的线粒体过度碎片化形态。机制上，A36提升了CAST蛋白水平，同时抑制了calpain-2的活性（表现为其底物α-spectrin II的切割减少）以及Drp1在Ser616位点的磷酸化（p-Drp1 S616），后者是驱动线粒体分裂的关键事件。
A36作为CAST–calpain-2复合体的PPI稳定剂发挥作用
DARTS结合质谱分析发现，A36能直接结合并稳定CAST蛋白。ASMS实验进一步揭示，A36选择性地与calpain-2单体及CAST–calpain-2复合体结合，而不与calpain-1或CAST–calpain-1复合体结合。免疫共沉淀证实，A36处理增强了内源性CAST与calpain-2之间的相互作用。功能上，敲低CAST或calpain-2（而非calpain-1）完全取消了A36对线粒体膜电位和细胞活力的保护作用，证明A36的神经保护效应严格依赖于CAST和calpain-2的存在，并且是通过特异性稳定两者之间的蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）来实现的。
A36治疗可恢复HD患者iPSC来源MSN的神经元功能和CAST表达
在源自亨廷顿病患者的iPSC分化而成的GABA能中型多棘神经元（medium spiny neurons, MSNs）中，A36治疗显著恢复了神经元标志物DARPP-32和突触后密度蛋白95（post-synaptic density protein 95, PSD-95）的表达，降低了p-Drp1 S616水平，增加了CAST蛋白并抑制了calpain-2活性。同时，A36挽救了HD-MSNs的轴突（neurofilament标记）和树突（MAP2标记）生长缺陷。
A36治疗可减轻HD R6/2小鼠的神经病理和运动缺陷
药代动力学显示A36具有良好的脑渗透性和较长的脑内暴露时间。在HD R6/2小鼠模型中，A36治疗（10 mg/kg/天，腹腔注射）延长了小鼠生存期，改善了运动功能（增加活动距离、减少后肢抓握行为），增加了纹状体中DARPP-32阳性神经元密度，减少了mtHtt聚集体，并提升了脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）水平。在机制上，A36治疗恢复了纹状体中降低的CAST水平，减少了calpain-2底物的切割，并增强了CAST与calpain-2之间的相互作用。
A36治疗可减轻PS19 tau小鼠的tau蛋白病变
在tau蛋白病PS19小鼠模型中，同样的A36治疗方案显著改善了小鼠的短期（Y迷宫）和长期（Barnes迷宫）空间记忆。在病理层面，A36减少了海马区磷酸化tau（AT8阳性）的沉积，缓解了神经炎症（降低GFAP和IBA1标记的星形胶质细胞和小胶质细胞激活），恢复了CAST水平，并抑制了calpain-2活性（p25和切割的α-spectrin II减少）及Drp1磷酸化。同时，A36增强了海马组织中CAST与calpain-2之间的相互作用。
研究结论与讨论
本研究成功开发并验证了A36——一种可透过血脑屏障、能选择性稳定CAST–calpain-2复合体的小分子PPI稳定剂。A36的作用机制并非直接抑制calpain的催化活性，而是通过“分子胶”样的作用，加固CAST与calpain-2之间的结合，从而防止CAST被降解，并限制calpain-2的病理性过度激活。这种机制选择性的干预方式，克服了传统广谱calpain抑制剂缺乏选择性和易产生毒副作用的问题，巧妙地利用了细胞自身的负反馈调控回路。
A36在多种疾病相关模型中（包括HD和tauopathy的细胞与动物模型）均展现出强大的保护效应：恢复线粒体形态与功能、减少氧化应激、降低致病蛋白（mtHtt和磷酸化tau）的聚集、减轻神经炎症、改善神经元存活以及动物的运动与认知行为。这些结果一致地证明了，药理性地稳定CAST–calpain-2复合体，是纠正神经退行性疾病中线粒体功能障碍和蛋白水解失衡的一个有效且具有广谱潜力的治疗策略。
该研究的重要意义在于：首先，它概念上创新性地将“稳定蛋白-蛋白相互作用”而非“抑制酶活性”作为治疗神经退行性疾病的新策略。其次，A36作为先导化合物，为后续开发治疗亨廷顿病、阿尔茨海默病（tau蛋白病）、以及其它涉及calpain-2异常激活的神经退行性疾病（如帕金森病、肌萎缩侧索硬化症）的药物提供了重要的起点和工具分子。最后，该研究强化了“CAST下调-calpain-2过度激活”轴作为多种神经退行性疾病共同节点（convergent node）的理论，为开发“以一治多”的广谱神经保护疗法提供了强有力的实验依据。当然，研究也指出A36在药代动力学（如体内半衰期）等方面仍有优化空间，其长期使用的安全性也需进一步评估。但毫无疑问，这项工作为对抗神经退行性疾病的黑暗长廊，点亮了一盏富有希望的新灯。
