《Veterinary Quarterly》：A dual-gene-deleted ASFV Lv17/WB/Rie1-ΔCD candidate administered orally to wild boar confers DIVA-compatible protection against virulent challenge
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为应对全球蔓延的非洲猪瘟(ASF)对野猪种群及养猪业的持续威胁，研究人员评估了一种新型口服减毒活疫苗Lv17/WB/Rie1-ΔCD。该疫苗通过删除EP402R(CD2v)和EP153R基因，在野猪模型中展示了优异的耐受性和保护效果，整体保护率高达90%，并实现了疫苗接种与自然感染动物的有效血清学鉴别(DIVA)。
非洲猪瘟，这个对全球养猪业构成巨大威胁的“不速之客”，其肆虐的脚步并未停歇。从欧亚大陆到美洲，这种由非洲猪瘟病毒引起的烈性传染病，不仅造成家猪近乎100%的死亡率，导致严重的经济损失，更在野猪种群中建立了顽固的“根据地”，成为病毒持续传播和扩散的天然“蓄水池”。传统的扑杀、隔离等手段在应对家猪疫情时尚可一搏，但对于行动自由、活动范围广阔的野猪而言，则显得力不从心。因此，研发一种安全、有效，且适用于野外投放的口服疫苗，被认为是切断病毒在野生动物-家畜间传播链条、实现长期防控的关键。然而，疫苗研发之路荆棘密布。灭活疫苗保护力不足，而早期的减毒活疫苗又常伴有安全性的隐忧，例如可能出现发热、毒力返强等不良反应。更棘手的是，一旦大规模接种疫苗，如何准确区分哪些动物是接种了疫苗，哪些是遭受了野外毒株的自然感染？这个问题（即所谓的DIVA，Differentiating Infected from Vaccinated Animals）直接关系到疫情监测的准确性和“无疫区”地位的认证。于是，科学家们将目光投向了一种经过改造的病毒“候选人”——Lv17/WB/Rie1-ΔCD。这项最新的研究成果发表在了《Veterinary Quarterly》期刊上。
为了评估这个疫苗候选株的潜力，研究团队主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们使用了来自西班牙塞维利亚商业农场的3月龄雌性野猪（Sus scrofa ferus）作为实验动物，在生物安全三级(BSL-3)设施内开展研究。其次，他们设计了两组口服免疫方案进行比较：高剂量单次免疫组（104TCID50）和低剂量-高剂量再次暴露组（先102TCID50，30天后104TCID50）。所有免疫动物及未免疫的对照组最终均通过肌肉注射途径，用高毒力的ASFV Armenia07 (Arm07)基因II型毒株进行攻毒，以检验保护效果。在检测方面，研究采用了世界动物卫生组织(WOAH)推荐的通用探针库实时荧光定量PCR(qPCR)来定量检测血液和组织中的病毒基因组载量（以Cq值表示）。同时，利用基于p72蛋白的商业化ELISA和专门针对缺失基因(pEP153R)及标记蛋白(eGFP)的ELISA进行血清学抗体检测，以评估免疫反应和DIVA能力。此外，还通过自动化生化分析仪监测了包括C反应蛋白(CRP)、肝肾功能指标在内的11项血清生化参数，综合评价疫苗的安全性与动物健康状况。最后，对攻毒后的动物进行了系统的组织病理学采样，并对阳性组织进行了病毒分离，以确认组织中感染性病毒的存在及其血吸附特性。
研究结果
疫苗接种期
疫苗表现出良好的安全性。在接种期间，大部分动物仅出现短暂的低度发热和轻微病毒血症（高Cq值，即低病毒载量）。高剂量单次免疫组（Group 1）中5/6的动物产生了抗体反应。低剂量-高剂量再次暴露组（Group 2）在首次低剂量免疫后，仅1只动物出现抗体反应，但在第二次高剂量免疫后，所有动物均成功血清转阳。
攻毒期
疫苗展现了强大的保护效力。所有产生免疫应答的动物均存活了下来，总体保护率达到90%（Group 1为83.3%，Group 2为100%）。相比之下，所有未接种的对照动物均在攻毒后6-7天内死亡或达到人道终点被安乐死。接种动物在攻毒后仅表现出轻微或无症状，病毒载量较对照组降低了超过103倍。统计分析表明，两次接种的策略（Group 2）在攻毒后能更有效地控制病毒复制和临床症状。
炎症标记物
血清C反应蛋白(CRP)监测显示，疫苗接种本身并未引起明显的炎症反应。攻毒后，单次接种组（Group 1）出现了短暂的CRP水平升高，而两次接种组（Group 2）则未观察到类似升高，表明两次免疫可能提供了更强的抗炎保护。
生化标记物
对肝、肾功能及代谢相关的一系列血清生化指标（如AST、ALT、肌酐、尿素等）的分析表明，疫苗接种未对动物肝、肾等主要器官功能产生毒性影响。攻毒后，单次接种组部分动物出现个别指标的短暂波动，但均很快恢复正常；两次接种组则基本未受影响，进一步印证了其优越的保护效果。
组织中病毒分布
定量PCR检测显示，接种动物组织中的病毒DNA阳性率和载量远低于对照组。在单次接种组（Group 1）中，71.7%的组织样本呈阳性；而在两次接种组（Group 2），这一比例降至38.3%，且平均Cq值更高（病毒载量更低）。病毒分离结果证实，在接种动物体内分离出的病毒多为攻毒用的Arm07野毒株，仅少数组织分离到了无血吸附能力的疫苗株，表明疫苗株在体内的复制和持久性有限。
DIVA分析
血清学DIVA检测结果理想。所有接种动物均产生针对p72蛋白和插入的eGFP标记蛋白的抗体，但均不产生针对被删除的EP153R蛋白的抗体。这种“p72阳性、eGFP阳性、EP153R阴性”的抗体谱，与自然感染野毒株（预期为p72阳性、EP153R阳性）的动物形成了清晰区分。所用组合ELISA方法能可靠地区分疫苗免疫和自然感染。
研究结论与意义
本研究系统评估了双基因缺失（ΔCD）的非洲猪瘟减毒活疫苗Lv17/WB/Rie1-ΔCD通过口服途径对野猪的免疫效果。结果表明，该疫苗候选株具有显著改进的安全性和强大的保护效力。与亲本株相比，其引起的临床反应更轻微。特别值得注意的是，采用“低剂量初免-高剂量再暴露”的口服策略，模拟了野外可能多次采食饵料的情况，能够诱导出更早、更一致的血清转阳，并在攻毒后提供近乎完全的保护，有效控制病毒在体内的复制和扩散。
这项研究的核心价值在于为解决非洲猪瘟野猪防控难题提供了一个极具前景的综合方案。首先，安全有效：ΔCD疫苗在保证高水平保护力（整体90%）的同时，大幅提升了安全性，仅引起短暂、轻微的反应，更适用于野外环境。其次，口服便捷：验证了口服免疫的可行性，这对于无法进行个体抓捕注射的野生种群而言是唯一实用的免疫方式。最后，也是至关重要的一点，具备DIVA能力：通过删除EP153R基因并引入eGFP报告基因，配合配套的血清学检测方法，能够准确区分免疫动物和自然感染动物。这一特性对于在实施疫苗接种后，继续开展精准疫情监测、维护区域无疫状态以及进行国际贸易至关重要。
综上所述，Lv17/WB/Rie1-ΔCD作为一种安全、有效、可口服且具备鉴别诊断能力的疫苗候选株，为控制非洲猪瘟在野生动物宿主中的传播，进而阻断其向家猪群的扩散，提供了强有力的新技术工具。当然，作者也指出，在投入大规模田间应用前，仍需对其长期安全性、遗传稳定性、环境中的行为以及大规模饵料投放策略等进行进一步评估。但毫无疑问，这项研究标志着我们在利用疫苗武器对抗非洲猪瘟的持久战中，迈出了坚实而富有希望的一步。
