实验室自建定性人巨细胞病毒(CMV)实时PCR检测在多种非血浆临床标本类型中的方法学一致性评估

《Viruses》：Inter-Method Agreement of a Laboratory-Developed Qualitative CMV PCR Assay Across Multiple Non-Plasma Clinical Specimens Murat Aral, Ayfer Bak?r, Cemal ?i?ek, Elif Tu??e Güner, Didem ?zkan, Gül?ah Ceylan Ya??z, Mehmet Morko?, Muhammed Furkan Kürk?ü, Yusuf üstün and Ebru Oru? + 13 authors

本研究针对目前商品化人巨细胞病毒(CMV) PCR试剂盒多针对血浆样本优化、缺乏在非血浆样本中性能验证数据的现状，评估了一种实验室自建的定性CMV实时PCR检测与商品化对照检测在支气管肺泡灌洗液、粪便、尿液、结肠镜活检、羊水和眼内液等非血浆样本中的一致性。结果表明该方法在非血浆样本中展现出显著的整体一致性（Cohen’s κ = 0.66），结果在粪便、尿液和侵入性标本中尤为一致，但在支气管肺泡灌洗液中一致性较低。该研究为实验室自建方法在复杂临床基质中的应用提供了重要的分析学数据。

在免疫系统健全的人群中，人巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染通常悄无声息，甚至不引起任何症状。然而，对于器官移植受者、造血干细胞移植患者、炎症性肠病患者以及有先天性感染风险的新生儿等免疫抑制或高风险人群而言，这种病毒却能引发严重的、甚至危及生命的疾病。及早检测CMV感染，对启动抗病毒治疗、预防临床并发症至关重要。目前，分子检测技术，特别是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)，因其高灵敏度、特异性、可重复性以及快速检测能力，已成为CMV实验室诊断的基石。

尽管血浆样本是诊断CMV感染的常用标本，但在评估感染的定位和范围时，对非血浆临床样本（如粪便、尿液、支气管肺泡灌洗液和各种组织活检标本）的分析同样不可或缺。然而，大多数商品化的实时PCR试剂盒主要针对标准化的血浆样本进行了优化，关于它们在多样化的非血浆样本类型中的分析性能和数据一致性，相关研究仍然较为匮乏。CMV检测的性能可能受到检测平台、靶向的病毒基因组区域、核酸提取方法以及所分析的临床样本类型等多种因素的影响。特别是在血浆以外的复杂样本中，PCR抑制剂的存在、低病毒载量水平以及CMV病毒在组织或体液中的异质性分布，都可能导致不同检测方法之间结果的不一致。这凸显了对这些样本类型进行比较性分析评估的必要性。本研究的目的正是为了填补这一空白，评估一种实验室自建的定性CMV PCR检测与一种商品化对照检测在各种非血浆临床样本类型中的方法学一致性。

本研究是一项前瞻性比较分析研究，共纳入了186份在2025年6月至2025年9月期间收集的临床样本。这些样本由安卡拉埃特利克市医院的儿科和成人患者提供，来源科室涵盖消化内科、呼吸科、眼科、围产期科、血液科、儿科消化与肝病科、新生儿科及儿科血液肿瘤科。最终，有166份样本在两种检测系统中均获得了有效的阳性或阴性结果，并被纳入最终的方法学比较分析。样本类型包括支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)、粪便、尿液、结肠镜活检、羊水和眼内液。血清、血浆和全血样本未被纳入研究。

研究使用一种靶向CMV病毒US17基因保守区域、并以人类β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参的实验室自建实时PCR检测，与商品化的artus^?CMV QS-RGQ (QIAGEN)试剂盒进行对照检测。所有样本均通过Molecision全自动核酸纯化系统提取总核酸，并使用相同的核酸提取物在Bio-Rad CFX96 Touch实时PCR检测系统上进行平行检测。检测结果定性判读为阳性或阴性。

统计上，依据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) EP12-A2指南，通过计算阳性符合百分比(Positive Percent Agreement, PPA)、阴性符合百分比(Negative Percent Agreement, NPA)、总体符合百分比(Overall Percent Agreement, OPA)以及Cohen’s kappa系数(κ)来评估两种检测方法之间的一致性。检测的分析灵敏度（95%检出限，LoD₉₅）则通过质粒DNA系列稀释的几率回归(Probit Regression)分析来确定。

3. 结果

3.1. 临床标本分布

在纳入分析的166份非血浆临床样本中，不同样本类型的CMV DNA阳性率存在差异。具体样本分布和总体阳性率情况在文章中已列出，但文档提供的图片和表格占位符未能显示具体数值。

3.2. 实验室自建定性CMV PCR检测与对照检测按标本类型划分的一致性

研究按样本类型分层评估了两种检测方法的一致性。数据显示，不同样本类型间的一致性程度显著不同。在所有样本总体评估时，两种方法表现出显著的整体一致性，总体Cohen’s kappa系数为0.66。

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  粪便样本中观察到很强的一致性，PPA为85.7%，NPA为92.6%，OPA为91.2%，Cohen’s κ为0.79。
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  尿液样本中也表现出相当的一致性，PPA为80.0%，NPA为95.8%，OPA为93.1%，Cohen’s κ为0.74。
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  侵入性样本组（包括结肠镜活检、羊水和眼内液样本）显示出最高的一致性，PPA达100%，NPA为96.3%，OPA为97.1%，Cohen’s κ高达0.93，表明一致性极好。
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  支气管肺泡灌洗液(BALF)样本显示出较低的一致性，PPA为45.5%，NPA为87.9%，OPA为81.2%，Cohen’s κ仅为0.36，表明一致性较弱。

上述结果通过图表形式进行了直观展示。

3.3. 分析灵敏度

通过几率回归分析确定，该CMV qPCR检测的LoD₉₅为63.8拷贝/微升，这对应于在测试条件下输入材料中约1.6 × 10⁴拷贝/毫升的检测限。该分析灵敏度是在使用质粒DNA且不经过核酸提取的受控条件下确定的，可能无法直接反映在富含抑制物的临床样本中基质特异性的分析灵敏度。

4. 讨论与结论

本研究表明，实验室自建的定性CMV实时PCR检测在多种非血浆临床样本类型中，与商品化对照检测相比，展现了显著的方法学一致性。这种一致性的水平因样本基质而异，反映出不同样本类型固有的生物学和分析学差异。

一致性在粪便、尿液和侵入性样本中较高，表明在这些基质中分析方法稳定、结果可靠。特别是粪便样本，尽管存在潜在的PCR抑制剂，但通过适当的核酸提取方案和内参控制策略，仍能获得稳定且高一致性，这支持了该检测在评估胃肠道CMV感染中的潜在应用价值。尿液和侵入性体液样本（羊水、眼内液）中的高一致性，也与既往研究相符，证实了这些样本类型用于CMV DNA定性检测的分析学适用性。

然而，在BALF样本中观察到的一致性较低，这可能归因于呼吸道样本的生物学异质性、潜在的病毒分布不均、目标浓度较低，以及基质相关的扩增变异性。BALF中存在的PCR抑制物、临床样本中CMV DNA检出与侵袭性肺炎之间缺乏恒定关联等因素，共同造成了这种较低的一致性。这提示，在分析BALF样本的CMV PCR结果时，需要谨慎解读，并结合临床表现、影像学和病理学数据进行综合判断。

该研究的一个核心观点是，其发现主要反映了两种分子检测方法之间的分析学一致性，而非明确的临床诊断准确性。由于所评估的检测被设计为定性检测，其目的并非用于病毒载量定量。研究也存在一些局限性，例如缺乏配对的血浆样本、部分样本组（特别是侵入性样本）的样本量有限、单中心设计可能限制结果外推性，以及缺乏对低病毒载量样本的定量比较。

总之，这项研究为实验室自建定性CMV PCR检测在多样化的非血浆临床样本基质中的应用提供了重要的分析学验证数据。它强调了在评估分子检测性能时考虑样本类型特异性因素的重要性，并为临床微生物实验室在复杂基质中实施和应用实验室自建检测提供了参考依据。未来，需要通过纳入更大队列、多中心验证以及结合定量PCR和标准化报告（如Ct值）的进一步研究，来增强这些观察结果的稳健性和临床适用性。