一种通过表观遗传学改良的全细胞疫苗，封装在刺激性水凝胶中，可有效增强抗肿瘤免疫力

《Biomaterials》：An epigenetically enhanced whole-cell vaccine in a stimulatory hydrogel for robust antitumor immunity

PCGF1抑制MHC-I表观遗传调控机制及CRISPR激活联合多糖水凝胶疫苗递送系统研究，揭示双基因编辑增强抗原呈递与异质性肿瘤抗原覆盖，通过STING通路激活实现高效抗肿瘤免疫应答。

李晓迪|宗晓青|袁鹏飞|严晓迪|杨彩琪|陈新杰|魏思颖|文尧琪|杜静茹|刘翔|刘凤英|戴健

广东高等教育机构生物材料重点实验室，广东省药物载体工程技术研究中心，济南大学生物医学工程系，中国广州510632

摘要

由于主要组织相容性复合体I类（MHC-I）的表观遗传抑制，导致抗原呈递不足，这是有效癌症免疫治疗的一个根本性障碍。通过全基因组CRISPR筛选，我们发现Polycomb组RING finger 1（PCGF1）是肿瘤细胞内在的MHC-I表观遗传抑制因子。单独敲除PCGF1即可消除MHC-I基因簇及其主调控因子NLRC5上的抑制性组蛋白修饰（H2AK119ub和H3K27me3），从而恢复细胞表面抗原呈递和免疫治疗敏感性。在此基础上，我们引入模块化工程策略以增强对肿瘤抗原异质性的转录响应能力。具体而言，使用CRISPR激活（CRISPRa）技术扩增内源性肿瘤抗原库，而不改变已恢复的抗原呈递机制。这些经过表观遗传重编程的细胞随后被冷冻灭活，并制成可注射的热敏性壳聚糖水凝胶，其中锰介导的STING激活作为免疫刺激佐剂，以增强抗原捕获和全身T细胞活化。总体而言，本研究确立了抗原呈递的表观遗传重编程作为全细胞疫苗设计的基本原理，并展示了如何通过模块化抗原和先天免疫增强来提高治疗效果，同时不掩盖核心机制。该平台为克服下一代癌症免疫治疗中的免疫抵抗提供了一个合理且可适应的框架。

引言

免疫疗法通过检查点抑制剂¹、过继细胞转移²、人重组细胞因子³和癌症疫苗⁴等策略彻底改变了癌症治疗。特别是阻断CTLA-4和PD-1通路，在多种恶性肿瘤中取得了持久的疗效^{5, 6, 7, 8}。然而，只有少数患者能从现有的免疫疗法中获益⁹。例如，高达70%的黑色素瘤患者对PD-1单药治疗无反应，许多初始响应者最终会复发^{10, 11}。治疗抵抗的一个核心原因是肿瘤的“免疫隐匿性”，这主要归因于两个相互关联的缺陷：(i) 主要组织相容性复合体I类（MHC-I）分子的下调，导致CD8⁺ T细胞无法识别抗原；(ii) 肿瘤相关抗原（TAAs）的丢失或低表达，限制了可靶向抗原的范围。

有效的抗原呈递对于免疫系统识别和清除恶性细胞至关重要。细胞内蛋白质被加工成肽并通过主要组织相容性复合体I类（MHC-I）分子呈递在细胞表面，供CD8⁺ T细胞识别^{12, 13}。然而，许多肿瘤通过下调MHC-I或破坏抗原加工机制（APM）^{14, 15}来逃避免疫检测，使它们对T细胞介导的杀伤作用不可见，从而限制了免疫检查点抑制剂（ICIs）的效果。此前，我们的团队开发了一种膜融合纳米平台，能够高效地将siRNA递送至肿瘤细胞¹⁶，从而增强MHC-I表达并部分恢复抗原呈递¹⁶。

肿瘤细胞通过肿瘤相关抗原（TAAs）被免疫系统识别¹⁷。除了抗原呈递缺陷外，TAAs的丢失或下调还会进一步削弱有效的抗肿瘤免疫¹⁸。尽管基于肿瘤抗原的疫苗旨在弥补抗原稀缺的问题¹⁹，但其疗效常常受到免疫原性弱、递送效率低、肿瘤异质性和免疫抑制微环境的影响^{20, 21, 22}。全肿瘤细胞疫苗通过呈现完整的抗原库，能够引发针对多种肿瘤克隆的多克隆T细胞反应^{23, 24}。然而，天然肿瘤细胞通常会分泌免疫抑制因子，如血管内皮生长因子（VEGF）²⁵、可溶性Fas配体（sFasL）²⁶、可溶性MHC I类多肽相关序列A（MICA）产物²⁷、白细胞介素-10（IL-10）²⁸和转化生长因子-β（TGF-β）²⁹——这些因子会抑制树突状细胞活性并促进免疫耐受。因此，工程化肿瘤细胞以同时增强抗原可见性和增加抗原可用性，同时消除其复制能力和免疫抑制潜力，是一个亟待解决的关键问题。

在这里，我们采用一种统一的策略，通过对肿瘤细胞进行双重基因重编程来应对这些挑战。通过全基因组CRISPR/Cas9筛选，我们发现Polycomb组RING finger蛋白1（PCGF1）是MHC-I表达的关键表观遗传抑制因子（图1a）。PCGF1敲除消除了MHC-I位点（H2-K^b/H2-D^b）及其转录激活因子NLRC5上的抑制性组蛋白标记（H2AK119ub和H3K27me3），恢复了MHC-I的表面表达并改善了抗原呈递。为了进一步扩大可靶向抗原的范围，我们在PCGF1缺陷细胞中引入了CRISPR激活（CRISPRa）系统，由dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1组成，驱动内源性TAAs的广泛转录上调。这种双重编辑策略产生了具有增强抗原（EA）的细胞，同时改善了抗原呈递和抗原多样性，从而直接解决了肿瘤免疫逃逸的两个主要机制（图1b）。

随后，EA细胞使用液氮冷冻灭活，生成非复制的LEA细胞，保留其工程化的免疫原性特征（图1c）。为了安全可控地给药，LEA细胞被封装在可注射的热敏性壳聚糖-锰（Cs–Mn）水凝胶中，其中Mn²⁺作为STING通路的激动剂，增强树突状细胞激活和抗原交叉呈递³⁰。由此产生的Cs-Mn-LEA疫苗能够诱导强烈的树突状细胞成熟、有效的CD8⁺ T细胞反应和持久的免疫记忆（图1d）。通过将双重基因编辑与基于生物材料的递送平台相结合，这一策略建立了一种可行且有效的现成全细胞癌症疫苗，为下一代癌症免疫治疗提供了转化框架。

部分内容摘要

全基因组CRISPR筛选发现PCGF1是MHC-I的负调控因子

为了系统地发现肿瘤中MHC-I表达的调控因子，我们在B16-F10黑色素瘤细胞中进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选，随后通过荧光激活细胞分选（FACS）分离出表面MHC-I水平高的克隆（图1a）。基于MAGECK的稳健等级聚合（RRA）分析确定了其靶向sgRNAs在MHC-Ihi群体中显著富集的基因（表S1）。

结论

总之，本研究确定PCGF1是肿瘤细胞内在的抗原呈递表观遗传调控因子，并证明PCGF1缺失是恢复MHC-I介导的免疫可见性的关键机制。通过解除Polycomb对NLRC5–MHC-I轴的抑制，PCGF1的丢失增强了肿瘤细胞对T细胞介导的免疫和免疫治疗的敏感性。在此基础上，我们进一步探索了旨在解决其他障碍的补充策略。

材料与方法

材料。氯化锌（ZnCl₂）、氯化锰（MnCl2）、5′-鸟苷一磷酸（GMP）、壳聚糖（95%脱乙酰度）和碳酸氢钠购自Aladdin。逆转录试剂盒和SYBR? Green qPCR Mix购自Yeasen Biotechnology Co., Ltd.（中国）。抗CD45-FITC、抗CD3-PE/Cy7、抗CD4-PE、抗CD8-APC、抗CD11b-FTIC、抗CD11c-FITC、抗CD86-PE、抗CD62L-PE和抗CD44-FITC购自BioLegend Inc.（美国）。抗CD80-APC购自...

CRediT作者贡献声明

杨彩琪：研究。严晓迪：研究、数据整理。袁鹏飞：研究、数据整理。宗晓青：写作–审稿与编辑、数据分析、概念化。戴健：资金获取、概念化。李晓迪：写作–初稿、方法学、研究、概念化。刘凤英：研究。刘翔：研究。杜静茹：研究。文尧琪：研究。魏思颖：研究。陈新杰：

数据可用性

数据可应要求提供。

伦理批准和参与同意

所有动物实验均获得了中国广东济南大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准编号：20220314-07）。临床肿瘤组织分析研究获得了济南大学伦理委员会的批准（批准编号：JNUKY-2024-008）。临床肿瘤组织样本是从存档的手术标本中回顾性获得的。由于使用了去标识化的样本，伦理委员会免除了知情同意的要求。

利益冲突

作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争利益。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢以下机构的财政支持：国家自然科学基金（32071381、21574148、21104097）、广东省自然科学基金（2021A1515010227、2014A030313152）、广州市科技项目（201904010151）以及中央高校基本科研业务费（21619418）。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备过程中没有发挥作用。