《Clinical Microbiology and Infection》：Clinical validation of a new multi-
Aspergillus species reverse transcriptase quantitative PCR: a diagnostic case-control study
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本研究为诊断侵袭性曲霉病（IA）这一临床难题提供了新策略。针对现有PCR方法在检测非烟曲霉等主要致病种上存在不足，研究者设计并验证了一种新型多重曲霉菌种特异性逆转录定量PCR（MAS-RTqPCR）。该方法可高灵敏度、高特异性地检测六大曲霉组（Fumigati, Flavi, Nigri, Terrei, Nidulantes, Usti）的核酸，临床性能优异，在诊断和患者随访中展现优势，是侵袭性曲霉病诊断的潜在有力工具。
侵袭性曲霉病（Invasive Aspergillosis, IA）是一种致命性的侵袭性真菌感染，常见于免疫功能低下的患者，如接受化疗的血液病患者或器官移植受者。其诊断一直是临床上的巨大挑战，因为它缺乏快速、高特异性且高灵敏度的诊断方法。传统诊断依赖影像学、培养和抗原检测（如半乳甘露聚糖检测），但这些方法各有局限：影像学表现缺乏特异性，培养耗时长且阳性率低，抗原检测可能出现假阴性与假阳性。近年来，聚合酶链式反应（PCR）技术因其快速、灵敏的优势，已被欧洲癌症研究与治疗组织/侵袭性真菌感染协作组（EORTC/MSGERC）指南接受为诊断侵袭性曲霉病的微生物学标准之一。然而，现有的曲霉PCR方法也存在痛点。例如，能检测多种曲霉的“广谱”曲霉PCR（pan-AspergillusPCR）可能与非目标真菌（如青霉菌）发生交叉反应，导致假阳性；而针对单一菌种（如烟曲霉A. fumigatus）的高特异性PCR，虽然准确性好，却会漏诊由其他曲霉种（如黄曲霉A. flavus、黑曲霉A. niger等）引起的感染，而这些非烟曲霉感染在临床中约占25%，不容忽视。此外，常规基于DNA的qPCR可能因靶标拷贝数有限而灵敏度不足。那么，能否开发一种既能覆盖主要致病曲霉种，又具有高灵敏度和高特异性的“一站式”检测方案呢？发表在《Clinical Microbiology and Infection》上的这项研究，正是为了解决这一难题。研究团队开创性地设计并验证了一种全新的多重曲霉菌种特异性逆转录定量PCR（Multi-Aspergillusspecies Reverse Transcriptase quantitative PCR, MAS-RTqPCR），为侵袭性曲霉病的精准诊断和患者管理提供了强有力的新工具。
研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：1. 基于28S核糖体RNA基因设计多重引物探针，建立了MAS-RTqPCR及其六个曲霉组（section）特异性RTqPCR检测体系。2. 采用病例对照研究设计，对总共120名患者（分为A、B、C三组）的223份血浆样本进行临床验证，样本来自巴黎圣路易医院的历史样本库以及一项名为OPTIFIL的前瞻性临床试验队列。3. 通过检测已知浓度的标准品，评估了方法的分析灵敏度（检测限）和分析特异性（针对超过90种真菌）。4. 将MAS-RTqPCR的性能与实验室已有的烟曲霉特异性qPCR（Af-qPCR）参考方法进行比较，并利用统计学方法（如卡帕系数、线性回归、Bland-Altman分析）评估其临床敏感性和特异性、一致性及相关性。
研究结果
MAS-RTqPCR的分析学性能
该检测方法的设计旨在克服广谱曲霉PCR的局限，同时保留物种特异性检测的优点。它通过检测全核酸（包括RNA和DNA）以提高灵敏度，并能一次性筛查六大主要致病曲霉组。分析验证显示，其检测限为每个反应5个拷贝（对烟曲霉），针对109株参考菌株的分析特异性达到100%。
MAS-RTqPCR与Af-qPCR在确诊侵袭性曲霉病患者（A组）中的临床敏感性对比**
在21名确诊为EORTC/MSGERC“很可能”侵袭性曲霉病的患者共44份血浆样本中，MAS-RTqPCR的阳性检出率为84.1%（37/44），显著高于Af-qPCR的65.9%（29/44）。在两种方法均为阳性的样本中，MAS-RTqPCR的Cq值显著低于Af-qPCR，表明其灵敏度更高。在患者水平的临床敏感性上，MAS-RTqPCR为0.91 [95% CI 0.71–0.98]，也优于Af-qPCR的0.76 [95% CI 0.55–0.89]。
MAS-RTqPCR在无侵袭性曲霉病患者（B组）中的临床特异性
在55名有风险但无侵袭性真菌病的患者样本，以及14名确诊为其他真菌病（镰刀菌病、毛霉病、组织胞浆菌病）的患者样本中，MAS-RTqPCR均未检测到非特异性扩增，临床特异性达到1.00 [95% CI 0.93–1.00]。
侵袭性曲霉病患者的纵向监测（C组）
在OPTIFIL前瞻性研究纳入的30名侵袭性肺曲霉病患者中，对所有时间点（第0、3、7、14、28天）的样本进行了监测。总体而言，MAS-RTqPCR在患者水平上检出了12名阳性患者（40%），而Af-qPCR检出13名（43.3%）。值得注意的是，在MAS-RTqPCR检出的12名阳性患者中，有3名患者未被Af-qPCR或烟曲霉组特异性RTqPCR（FuSS-RTqPCR）检出，但通过其他组特异性检测（Flavi, Nigri, Nidulantes）被确认，表明他们感染了非烟曲霉。在动力学方面，MAS-RTqPCR在诊断日（第0天）的检出率（75%）高于Af-qPCR（46.2%），并且部分患者在治疗开始后（如第3、7天）才出现PCR阳性，提示了治疗初期核酸释放的动态变化。相关性分析显示，MAS-RTqPCR与Af-qPCR的Cq值具有良好的一致性。
研究结论与意义
本研究成功开发并验证了一种新型的、基于逆转录酶的多重曲霉菌种特异性定量PCR（MAS-RTqPCR）。其核心结论是，该方法是一种极具前景的侵袭性曲霉病诊断工具。与传统的、仅针对烟曲霉的qPCR相比，MAS-RTqPCR具有以下显著优势：更高的临床灵敏度，这得益于RT-qPCR能同时检测核糖体RNA和DNA，增加了可检测的靶标数量；更广的检测谱，可覆盖六大主要致病曲霉组，从而能够发现由非烟曲霉（如黄曲霉、黑曲霉等）引起的、可能被传统方法漏诊的感染；优异的特异性，在分析验证和临床验证中均未出现与其他真菌的交叉反应。此外，通过纵向监测，研究发现MAS-RTqPCR能够更早（在诊断日）或在治疗后的动态监测中检出阳性，这可能为那些初始诊断性检查阴性但又高度怀疑感染的患者提供了一个有价值的补充检测窗口。该研究不仅为临床实验室提供了一种高效、可靠的“一站式”筛查方案（先通过MAS-RTqPCR初筛，阳性后再用组特异性检测确定病原），其基于RNA检测提高灵敏度的策略也为其他病原体的分子诊断提供了新思路。总之，这项由Marion Benazra等人完成的工作，通过巧妙的设计和严谨的临床验证，显著推进了侵袭性曲霉病的分子诊断水平，有望改善高危患者的早期诊断、精准治疗和预后管理。
