《Journal of Ethnopharmacology》：Salvianolic acid C, a novel pyroptosis inhibitor, attenuates podocyte injury in diabetic kidney disease through regulating miRNA-21/A20 pathway
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本研究筛选出丹参中 salvianolic acid C（Sal C）能抑制AGE诱导的MPC-5细胞足细胞凋亡，并通过调节miRNA-21/A20信号通路抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD途径，有效改善db/db小鼠的肾功能和足细胞损伤。
作者名单：向世霞、史先聪、吕明珠、高盖、王攀、马慧芬、徐江燕、谢志深、张晓伟、李根林
中国河南省郑州市河南中医药大学药学院，邮编450046
摘要
民族药理学意义
丹参（Salvia miltiorrhiza）是一种传统中药，临床上被用于糖尿病肾病（DKD）的治疗。然而，其肾脏保护作用的具体生物活性成分和分子机制尚不清楚。
研究目的
本研究旨在识别能够减轻足细胞焦亡的
丹参活性化合物，并阐明其在DKD中的分子机制。
材料与方法
使用Gaussia luciferase报告基因检测系统对生物活性化合物进行系统性筛选，并通过测量AGE（晚期糖基化终产物）诱导的MPC-5细胞的存活率和LDH释放量进行进一步验证。在
db/db小鼠中通过检测尿微量白蛋白、白蛋白与肌酐比值、血清肌酐、血尿素氮和肾脏组织病理学来评估潜在活性成分的效果。通过Western blotting、免疫组织化学以及使用特定的NLRP3激活剂（Nigericin）、A20 siRNA和miRNA-21模拟物来研究分子机制。
结果
系统性筛选发现丹参酚酸C（Sal C）是AGE诱导的MPC-5细胞焦亡的强效抑制剂。随后，Sal C显著改善了
db/db小鼠的肾功能和足细胞损伤，表现为肾功能参数的改善和肾小球病理学的减轻。在体外和体内实验中，Sal C均抑制了NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路的激活。与Nigericin（特定的NLRP3激活剂）联合使用会减弱Sal C对足细胞损伤的保护作用。关键的是，Sal C上调了miRNA-21的表达，从而增强了A20的表达。A20 siRNA和miRNA-21模拟物均消除了Sal C对NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路介导的足细胞焦亡的抑制作用。
结论
Sal C通过调节miRNA-21/A20信号通路来保护DKD中的足细胞，从而抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡通路的激活。
引言
糖尿病肾病（DKD）是一种慢性肾脏疾病，主要特征是持续性蛋白尿和进行性肾功能衰竭（Cheng, H.T.等人，2021；Sun等人，2023）。肾小球滤过屏障的结构和功能完整性对于维持正常的肾功能至关重要，其破坏在DKD的发病机制和进展中起着核心作用（Kushwaha等人，2022）。足细胞作为肾小球滤过屏障的重要组成部分，在糖尿病背景下极易受损（Agrawal等人，2021）。足细胞损伤已被确定为DKD患者肾小球滤过功能障碍的核心病理特征（Brosius和Coward，2014；Tuttle等人，2022）。因此，保护足细胞结构和功能的策略是治疗DKD的一种有前景的方法。
焦亡是一种程序性炎症细胞死亡形式，依赖于gasdermin家族蛋白的激活（Ding等人，2016）。Gasdermin D（GSDMD）是由炎症相关caspases（包括caspase 1、4、5和11）触发焦亡的主要执行者（Shi等人，2015）。经典的NLRP3炎性体通路涉及ASC依赖的复合体组装，激活caspase-1，进而调控GSDMD的蛋白水解过程并介导促炎细胞因子的成熟（Hu等人，2024）。越来越多的证据表明，NLRP3、caspase-1和白细胞介素-1β（IL-1β）的表达水平显著升高，GSDMD介导的焦亡在DKD动物模型中导致足细胞损伤（Hu等人，2024）。值得注意的是，抑制caspase-1已被证明可以显著减轻DKD中的肾脏损伤（Cheng, Q.等人，2021）。形态学上，焦亡细胞表现出质膜肿胀和囊泡形成，随后囊泡破裂，细胞内物质（包括炎症介质）释放到细胞外环境中（Liu等人，2016）。这一过程会引发炎症反应，这与DKD患者中炎症因子过度积累的情况一致。总体而言，这些数据表明，针对NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路可能为通过减轻足细胞损伤来保护肾功能提供一个潜在的治疗靶点（Al Mamun等人，2021）。
锌指蛋白A20（也称为肿瘤坏死因子α诱导蛋白3，TNFAIP3）在NLRP3激活中起负调节作用，能有效抑制焦亡过程（Vande Walle等人，2014）。微小RNA（miRNAs）是一类序列高度保守的小非编码RNA分子，通过特异性结合目标miRNAs的3’非翻译区在基因表达中发挥关键调节作用（Lorenzen等人，2011）。越来越多的证据表明，DKD患者的肾组织中miRNA-21的表达显著升高（Tang等人，2019）。下调miRNA-21已被证明可以减轻肾脏损伤，提示其作为DKD的治疗靶点（K?lling等人，2017；McCllland等人，2015）。此外，研究表明miRNA-21通过直接靶向和抑制A20的表达来调节NLRP3（Ding等人，2021；Xue等人，2019）。
丹参是传统中药中最常用的草药之一。先前的研究表明丹参在预防和治疗DKD方面具有显著的治疗潜力（An等人，2017；Lee等人，2011；Xu等人，2016）。因此，它经常被纳入传统中药方案中用于DKD的临床治疗（Lin等人，2020）。酚酸是丹参中的主要生物活性成分。几种酚酸化合物，如丹参素和丹参酚酸A，已被证明具有保护肾脏免受损伤和改善肾功能的作用（Chen等人，2023；Xu等人，2024）。然而，这些化合物对DKD中足细胞损伤的保护作用及其潜在的分子机制仍不完全清楚，需要进一步研究。
在这项研究中，我们首先对丹参中的主要丹参酚酸成分进行了活性筛选，发现丹参酚酸C（Sal C）对足细胞焦亡具有潜在的抑制作用。基于这些初步发现，我们利用db/db小鼠和AGE诱导的足细胞损伤模型系统评估了Sal C对DKD的治疗效果及其抑制足细胞焦亡的能力，并进一步研究了其潜在的分子机制。我们的研究结果表明，Sal C通过下调miRNA-21的表达来抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD介导的足细胞焦亡，从而增加A20蛋白水平，最终有助于缓解DKD。
化学物质和抗体
丹参酚酸化合物购自中国成都的Mansite Biotechnology或上海的Yuan Ye Biotechnology，纯度大于98%，详细信息见补充表1。缬沙坦（Val）来自中国北京的Novartis Pharma。Nigericin（Nig）购自美国新泽西的MedChemExpress。干扰素-γ（IFN-γ）购自美国新泽西的PeproTech。AGEs-BSA来自英国剑桥的Abcam。
Sal C作为焦亡抑制剂减轻足细胞损伤
为了识别丹参中来源于酚酸化合物的潜在焦亡抑制剂，我们建立了一个包含17种丹参酚酸的化合物库（详细信息见补充表1），并首先使用CCK-8检测和LDH释放检测进行了系统功能评估。如图1A和1B所示，AGE处理的足细胞（MPC-5细胞）表现出存活率下降和LDH释放量显著增加
讨论
大约30%的1型糖尿病患者和20%的2型糖尿病患者最终会发展为DKD（Sun等人，2023；Zhu等人，2023）。超过一半的DKD患者死于肾衰竭，这是糖尿病患者的主要死因之一（Sun等人，2023；Zhu等人，2023）。目前的临床干预措施主要集中在血糖控制、血压管理和脂质调节上。然而，这些策略的效果有限
结论
我们的研究表明，Sal C可能是一种新的焦亡抑制剂，可用于治疗DKD。我们进一步研究了这些作用机制，发现Sal C通过调节miRNA-21/A20通路来抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD依赖的焦亡。这些发现为GSDMD依赖的焦亡提供了新的见解，揭示了Sal C治疗作用的新机制
作者贡献声明
马慧芬：方法学。
徐江燕：写作 – 审稿与编辑，资金获取。
谢志深：监督，项目管理，方法学。
张晓伟：写作 – 审稿与编辑，监督，项目管理，方法学，资金获取。
李根林：写作 – 审稿与编辑，监督，项目管理，方法学。
向世霞：写作 – 初稿撰写，验证，数据管理。
史先聪：验证，数据管理。
吕明珠：数据管理。
高盖：
本工作得到了国家自然科学基金（编号82474495、82104471）、国家重点研发计划（编号2020YFE0201800）以及河南省高等学校科技创新人才计划（编号24HASTIT072）的财政支持。我们感谢河南中医药大学的动物实验中心和电子显微镜中心的协助。
