《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：De novo transcriptome analysis of somatic embryogenesis induced by plant hormones combined with adenosine 5-monophosphate and nicotinamide adenine dinucleotide molecules in
Aspilia africana (Pers.) C.D.Adams
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本研究聚焦药用植物非洲紫菊(Aspilia africana)因繁殖困难导致的资源稀缺问题，研究人员通过联合应用植物激素与腺苷-5′-单磷酸(AMP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，成功诱导了其体细胞胚发生(SE)。通过对其非胚性叶(NEL)、球形胚叶(GEL)和子叶胚叶(CEL)三个阶段进行de novo转录组测序，首次揭示了该物种SE过程的分子机制。研究发现8669个差异表达基因，植物激素信号转导通路（特别是生长素和细胞分裂素）及相关SE候选基因（如SERK2、ERF12、LEA14-A）显著富集。该工作不仅首次报道了A. africana的de novo转录组，为理解激素与其他分子协同诱导SE的机制提供了新见解，也为该药用植物的分子育种、人工种子生产等应用研究奠定了关键资源基础。
在非洲，有一种名为非洲紫菊(Aspilia africana)的菊科灌木，它不仅被当地社区广泛用于治疗疟疾、胃溃疡等多种疾病，还是牲畜重要的饲草来源。然而，随着人类需求激增，其野生种群正面临锐减的威胁。雪上加霜的是，该植物通过种子繁殖的成功率极低，传统的繁衍方式难以为继。如何在保护野生资源的同时，实现其高效、可持续的繁殖，成为了一个亟待解决的难题。在植物生物技术领域，体细胞胚发生(Somatic Embryogenesis, SE)是一种“神奇”的技术，它能够让普通植物体细胞绕过受精过程，直接发育成一个完整的胚胎，进而再生为植株。这项技术是人工种子生产、克隆繁殖和遗传改良的利器。此前，科学家们已成功利用植物激素，结合腺苷-5′-单磷酸(Adenosine 5′-monophosphate, AMP)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)这两种促有丝分裂分子，从非洲紫菊叶片中诱导出了直接体细胞胚发生。然而，这个过程背后复杂的分子“剧本”——哪些基因被激活，哪些通路在“指挥”——仍然是个未解之谜。为了揭开这一层神秘面纱，由Roggers Gang、Ariranur Haniffadli等人组成的研究团队，首次对植物激素联合AMP、NAD诱导非洲紫菊体细胞胚发生的过程进行了de novo转录组分析，揭示了其关键的分子调控网络，相关成果发表在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》上。
为了回答上述问题，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：首先，建立了非洲紫菊的组织培养体系，通过外源添加细胞分裂素(BAP)和AMP进行胚诱导，再使用脱落酸(ABA)和NAD进行胚分化与成熟，从而获取了三个关键发育阶段（培养0天的非胚性叶NEL，培养21天的球形胚叶GEL，培养28天的子叶胚叶CEL）的样本。其次，利用Illumina NovaSeq 6000平台对这三个阶段的样本进行了高通量RNA测序(RNA-seq)。再次，针对没有参考基因组的非洲紫菊，研究人员使用Trinity软件对测序数据进行de novo转录本组装。然后，利用BLAST、GO和KEGG数据库对组装的转录本进行了功能注释。最后，运用生物信息学工具（如edgeR）进行差异表达基因(DEGs)分析，并通过定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)对关键基因的表达模式进行了实验验证。
诱导体细胞胚发生
研究人员成功地在添加了BAP和AMP的培养基上诱导出了球形胚，并在后续含有ABA和NAD的培养基上促使其发育为子叶胚，为后续的分子分析提供了明确的形态学阶段样本（NEL, GEL, CEL）。
测序、转录组的de novo组装和注释
对三个阶段样本的测序共产生超过3.18亿条高质量读段，组装得到200,130条转录本，平均长度822.11 bp。其中，31.44%的转录本在Nr数据库中得到注释。基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析显示，大量基因参与了分子功能、细胞组分和生物过程，并富集于植物激素信号转导、碳代谢等关键通路。
差异表达基因
通过比较三个样本组，共鉴定出8669个差异表达基因。在SE过程中，下调基因的数量多于上调基因。NEL vs GEL比较中差异基因最多（7,895个），而GEL vs CEL比较中差异基因最少（67个），表明从非胚性状态向胚性状态转变是基因表达发生剧烈重编程的关键时期。
差异表达基因功能注释
对差异表达基因的功能富集分析显示，下调基因主要与光合作用、光响应、叶绿体组织等过程相关，而上调基因则显著富集于羧酸代谢、核苷酸代谢、细胞分裂以及碳代谢和TCA(三羧酸循环)通路，这反映了细胞从光合自养状态向活跃分裂和代谢的胚胎发育状态转变。
非洲紫菊SE过程中植物激素信号通路相关基因的差异表达分析
KEGG分析表明，植物激素信号转导是最具代表性的通路之一。研究人员重点分析了生长素和细胞分裂素信号通路。研究发现，多个参与生长素信号转导的基因，如生长素响应因子ARF5、ARF4以及SAUR、GH3、IAA9等在胚性组织中表达上调。同时，细胞分裂素信号通路中的受体基因CRE1和响应调节因子ARR-A也呈现差异表达。此外，乙烯、赤霉素、脱落酸等其他激素信号通路的相关基因也发生了显著变化，表明激素及其交互作用在非洲紫菊SE过程中扮演了核心调控角色。
差异表达的体细胞胚发生候选基因
通过与已知数据库比对，研究人员鉴定出一系列在体细胞胚发生中起关键作用的候选基因，并证实它们在非洲紫菊SE过程中显著上调。这些基因包括：
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SERK2(体细胞胚发生受体激酶2)：表达量增加3.9倍，该基因通常与细胞获得胚性潜能相关。
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ARF5(生长素响应因子5)：表达量激增18.2倍，是调控胚胎发育的核心转录因子。
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IAA9(生长素/吲哚-3-乙酸基因9)：表达上调2.5倍，参与生长素信号传导。
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PYL4(脱落酸受体PYR1-LIKE 4)：表达上调2.9倍，是ABA信号通路的关键组分，可能促进细胞全能性。
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ERF12、ERF11、ERF2(乙烯响应因子)：表达分别上调10.1、4.7和6.1倍，这些AP2/ERF家族转录因子有助于维持分生组织状态。
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LEA14-A(晚期胚胎发生丰富蛋白14-A)：表达上调13.7倍，可能在胚胎成熟和脱水耐受中起保护作用。
通过qRT-PCR验证体细胞胚发生相关差异表达基因
研究人员选取了FLA4、HSP17、ERF12等8个SE相关基因进行qRT-PCR验证。结果显示，这些基因在胚性组织(GEL和CEL)中的表达水平显著高于非胚性组织(NEL)，与RNA-seq数据呈中度相关(R=0.628)，证实了高通量测序结果的可靠性。
研究结论与意义
本研究首次成功构建了非洲紫菊在植物激素联合AMP、NAD诱导的体细胞胚发生过程中的de novo转录组图谱，并系统分析了其基因表达动态。核心结论是，尽管诱导剂中包含了AMP和NAD等非激素分子，但SE过程的分子机制与单纯由植物激素诱导的机制可能相同或相似。研究揭示了以下关键点：1. 植物激素信号转导（尤其是生长素和细胞分裂素通路）是SE过程的核心调控网络；2. 一系列已知的SE关键标记基因（如SERK2、ARF5、ERFs、LEA14-A）在非洲紫菊SE过程中被特异性激活，共同协作推动细胞获得胚性能力和胚胎发育程序的执行；3. 从非胚性组织向胚性组织的转变伴随着大规模的基因表达重编程，而胚性组织内部（球形胚到子叶胚）的转录组变化相对较小。
这项研究的意义重大。首先，它为解决非洲紫菊这一重要药用和饲用植物的繁殖困境提供了关键的分子生物学见解和丰富的基因组资源，为后续通过基因工程手段优化其体细胞胚发生效率、实现大规模人工繁殖奠定了坚实基础。其次，该工作首次深入探究了植物激素与其他促有丝分裂分子（AMP和NAD）协同作用下的SE分子机制，扩展了人们对植物细胞全能性调控网络的认识，为植物胚胎发育生物学研究提供了新的案例和视角。最后，所构建的高质量转录组数据库和鉴定的关键基因，将成为未来开展非洲紫菊功能基因组学、遗传改良以及更广泛的植物生物技术研究的重要平台。
