《The Journal of Molecular Diagnostics》：Performance evaluation of a PCR/Nanopore assay for carrier screening for cystic fibrosis, spinal muscular atrophy, and fragile X syndrome
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基于PCR/Nanopore测序的多基因联合检测方法，验证了CFTR、SMN1/2和FMR1基因中致病突变及拷贝数变异的检测能力，包括CFTR聚-T状态、SMN2拷贝数及FMR1 CGG重复扩展与AGG中断。该单一体流程方法较传统panel更优，可检测10%嵌合性FMR1突变，经AmplideX软件分析后与正交方法一致（CFTR 97%，SMN1/2和FMR1 100%），证明其准确性和可重复性。
Kendall E. Martin | Fernanda Sábato | Jesse Lynch | Andrea Ferreira-Gonzalez | Elizabeth S. Barrie
来自弗吉尼亚联邦大学病理学系，里士满，VA
摘要
囊性纤维化、脊髓性肌萎缩症和脆性X综合征是最常见的遗传性疾病之一，因此对高风险夫妇进行携带者筛查至关重要。传统的筛查方法通常涉及多个工作流程，可能会遗漏一些罕见变异。而全面的测序技术能够在不同人群中更广泛地检测到变异。我们验证了一种基于PCR/Nanopore的检测方法，用于全面评估CFTR、SMN1/2和FMR1基因的变异。样本包括来自以下来源的匿名DNA：全血（存档临床样本，n = 53）、细胞系（n = 19）以及CAP能力测试剩余材料（n = 3）。使用AmplideX Nanopore Carrier Plus试剂进行基因特异性PCR扩增，随后在MinION流式细胞仪上进行条形码化和测序。数据通过AmplideX One Reporter软件进行分析。对于SMN1/2和FMR1基因，该方法与正交方法（实验室开发的PCR/片段分析测试）的结果一致率达到100%；对于CFTR基因，一致性为97%。这些结果在重复实验中具有可重复性。研究表明，基于PCR/Nanopore的检测方法能够准确且可重复地识别CFTR基因的致病性变异和多T重复序列、SMN1/2基因的拷贝数及SNP变异，以及FMR1基因的CGG重复序列长度和AGG中断。该方法甚至能够检测到低至10%的FMR1基因嵌合现象。这种单一工作流程能够实现对多种疾病的准确、可重复的筛查，并且能够检测到比传统基因分型面板更多的CFTR基因变异。
引言
携带者筛查是一种基因检测方法，旨在识别可能生育患有常染色体隐性或X连锁遗传病孩子的个体或夫妇。历史上，携带者筛查的建议部分基于种族因素；然而，最近的指南正朝着更加包容、覆盖整个人群的方向发展
1 。美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）建议对所有目前怀孕或计划怀孕的个体提供携带者筛查
1 。扩展的携带者筛查指南包括113个基因，这些基因的携带者频率超过1/200，其中包括X连锁疾病
1 。尽管扩展携带者筛查越来越普遍，但个人决策应基于个人因素，包括家族史
2 ，有些患者可能会选择针对性的筛查。值得注意的是，囊性纤维化（CF）、脊髓性肌萎缩症（SMA）和脆性X综合征（FXS）是最常见的需要针对性携带者筛查的遗传疾病
3 。
CF是一种常染色体隐性遗传病，由CFTR基因的致病性变异引起，目前已鉴定出超过一千种变异
https://cftr2.org/mutations_history 4 。然而，基于面板的筛查方法在检测所有潜在致病性变异方面的能力有限。全面的CFTR基因测序能够在不同人群中提供更好的覆盖范围，从而在检测结果为阴性时降低风险。
SMA是一种常染色体隐性遗传病，最常见的是由SMN1基因第7外显子的缺失引起。虽然95%的病例是由于第7外显子的纯合缺失导致的，但SMN1基因内的其他致病性变异也可能引起疾病5 。SMA的临床严重程度部分取决于个体中SMN2基因的拷贝数。SMN2是一种几乎相同的基因，能产生少量的功能性SMN蛋白，因此增加SMN2的拷贝数可以减轻SMA的症状，而SMN2拷贝数较少则会导致最严重的SMA形式。SMN1的携带者状态通常通过PCR或MLPA来检测第7外显子的拷贝数来确定。由于SMN1和SMN2基因之间的序列高度相似，对SMN1进行全基因测序具有挑战性。
值得注意的是，有些人可能是SMN1的“沉默携带者”，即在一个染色体上拥有两个SMN1基因拷贝，而在同源染色体上没有拷贝。标准检测方法无法识别这些携带者，尽管他们有可能传递没有功能性SMN1基因的染色体。某些单核苷酸多态性（SNP）可以标记这种单倍型，并与成为沉默携带者的风险增加相关6 ,7 。
FXS是一种X连锁遗传病，由FMR1基因5’非翻译区（UTR）中的CGG三核苷酸重复扩展引起，是最常见的遗传性智力障碍原因。具有大约55-200个CGG重复序列的个体是FXS的携带者，这种重复数量被认为是“前突变”，有可能在后续世代中扩展为完全突变（>200个重复）。扩展的风险还受到中间AGG中断的影响，这些中断可以稳定该区域8 。虽然只有完全突变才会导致FXS，但前突变也可能导致临床表现，包括原发性卵巢功能不全和震颤/共济失调综合征9 ,10 ,11 。此外，还发现了具有多种FMR1基因CGG重复序列长度的嵌合个体，这可能导致表型变异12 。历史上，FMR1重复序列的检测使用Southern印迹法进行；然而，目前主流的方法是三核苷酸重复引物PCR。由于重复序列的存在以及该区域的高GC含量，FMR1的测序一直很困难。
长读长测序技术的发展为测序基因组中的复杂区域提供了可能，这些区域由于重复序列、结构变异和高GC含量而难以用短读长测序技术处理。Nanopore测序是一种长读长测序技术，通过监测DNA分子通过纳米孔时的离子电流变化来识别DNA序列，每个核苷酸会产生一个独特的信号，可以解码为其对应的碱基13 。最近，开发了用于遗传病携带者筛查的长读长测序方法14 ,15 ,16 。在这项研究中，我们评估了一种使用AmplideX Nanopore Carrier Plus试剂盒（Asuragen）开发的实验室测试的性能特征。该测试首先通过PCR富集，然后进行长读长测序，以检测CFTR基因的致病性变异（包括ACMG推荐的100种变异）、SMN1和SMN2的拷贝数和变异检测，以及FMR1的CGG重复序列长度和AGG中断的确定。这些验证研究包括分析准确性、分析精度/可重复性，并使用已建立的比较方法（正交方法）进行方法比较。 样本
样本
样本包括来自以下来源的DNA：匿名存档临床样本的全血（n = 53）、细胞系（n = 19）以及美国病理学学院（CAP）能力测试剩余样本（n = 3）（补充表1）。该样本池包括21个至少携带一种CFTR致病性变异的样本、23个SMN1第7外显子拷贝数为1或0的样本、31个SMN2拷贝数为1或0的样本，以及17个FMR1携带前突变或完全突变的样本
CFTR
通过将结果与正交方法进行比较来评估分析准确性。测试样本包括17个携带CFTR致病性变异的杂合子样本、4个纯合子（n = 1）或复合杂合子（n = 3）样本，以及52个野生型（WT）样本。这些样本代表了正交方法检测到的14种独特的CFTR致病性变异（表1，补充图S1）。
使用AmplideX Carrier Plus试剂进行长读长测序
讨论
携带者筛查已成为希望了解自己生育患有常染色体隐性或X连锁遗传病孩子风险的个体和夫妇的常规做法。随着参与携带者筛查的个体数量增加，检测被筛查基因中罕见变异的需求也在增加。传统的携带者筛查方法主要针对特定基因中最常见的致病性变异进行靶向基因分型。虽然这种方法有效，但...
结论
本研究验证了一种使用PCR/Nanopore测序技术的稳健、准确且可重复的检测方法。该方法能够准确检测多种基因的携带者状态，并且能够检测到比传统基于面板的基因分型方法更多的致病性变异。它可以在单一工作流程中合并样本并对多个基因进行测序，其成本与单独运行这些检测方法相当。
致谢
作者感谢Asuragen（德克萨斯州奥斯汀）的Ninad Pendse和Vivian Le提供的技术支持。
