《Materials Today Bio》：Targeted delivery of Lupeol via hyaluronic acid-modified ZIF-8 for anti-hepatic fibrosis therapy
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本研究针对代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）进展为肝纤维化（HF）的临床难题，开发了一种新型的透明质酸（HA）修饰、ZIF-8负载的羽扇豆醇（Lupeol）纳米递送系统HA/Lupeol@ZIF-8。该系统通过CD44靶向和pH响应性药物释放，精准作用于活化的肝星状细胞（aHSCs），有效激活FXR-SHP通路，抑制纤维化标志物表达，并释放Zn2+协同抑制糖酵解，在细胞和动物模型中均证实了显著的抗纤维化效果，为肝纤维化的靶向治疗提供了新策略。
肝纤维化是各种慢性肝损伤的最终“疤痕”，它悄无声息地发展，却可能导致肝硬化甚至肝癌。在这场“疤痕形成”的复杂战役中，活化的肝星状细胞（aHSCs）是主要的“施工队”，它们过度活化、增殖，并疯狂分泌细胞外基质。因此，精准“打击”aHSCs，阻止其活化，成为逆转肝纤维化的关键策略。在众多驱动肝纤维化的因素中，代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD，曾用名非酒精性脂肪肝病NAFLD）是重要“推手”。研究人员前期发现，一种名为羽扇豆醇（Lupeol）的天然五环三萜类化合物，可以通过激活肝脏中的FXR-SHP信号通路，有效改善MASLD。然而，羽扇豆醇自身存在水溶性差、稳定性低、在体内代谢快、且难以精准靶向病变部位等缺点，严重限制了其临床应用价值。为了破解这些难题，研究人员将目光投向了纳米技术和靶向递送。
这篇发表在《Materials Today Bio》上的研究，正是瞄准了这一临床痛点。研究人员构想并构建了一种“智能导航”的纳米“运输车”——HA/Lupeol@ZIF-8。这辆“运输车”以金属有机框架材料ZIF-8为“车厢”，装载了“货物”羽扇豆醇，并在车厢表面安装了“导航头”透明质酸（HA）。这个设计的巧妙之处在于：HA能特异性识别aHSCs表面高表达的CD44受体，实现主动靶向；而ZIF-8“车厢”在正常生理环境中稳定，但在肝纤维化区域的弱酸性微环境中会迅速“解体”，实现pH响应性药物释放。这样一来，药物就能精准送达aHSCs，并在病灶处高效释放。不仅如此，ZIF-8降解时释放的Zn2+离子还能抑制aHSCs的糖酵解过程，与羽扇豆醇产生协同抗纤维化作用。
为了验证这个精巧的设计，研究人员运用了一系列关键技术方法。在材料制备与表征方面，他们采用室温溶液反应法合成了HA/Lupeol@ZIF-8纳米颗粒，并通过透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）等手段对其形貌、尺寸、电位、结晶结构及化学组成进行了系统表征。他们还通过体外释放实验验证了其pH响应性释药特性。在体外功能验证上，研究利用人源肝星状细胞（LX-2）和大鼠肝星状细胞（HSC-T6）等细胞模型，通过CCK-8、细胞划痕、Western blot、活性氧（ROS）检测、乳酸脱氢酶（LDH）活性及乳酸/ATP含量测定等实验，评估了纳米系统的细胞毒性、靶向摄取、抗活化、抗迁移、抗氧化及抑制糖酵解等效果。在体内药效与机制研究中，他们构建了CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型，通过尾静脉注射给药，评估了HA/Lupeol@ZIF-8的治疗效果。研究通过小动物活体成像、组织病理学染色（H&E、天狼星红、Masson）、免疫组化/免疫荧光、血清生化指标检测以及Western blot分析肝脏组织蛋白表达等手段，全面评价了其靶向性、抗纤维化疗效及对FXR-SHP等信号通路的调控作用。
研究人员开展了一系列实验，取得了以下主要结果：
3.1. HA/Lupeol@ZIF-8的合成
研究成功制备了HA/Lupeol@ZIF-8纳米颗粒，其平均粒径为125.7 ± 0.16 nm，药物负载量和包封率分别高达23.8%和97.4%。表征结果证实了ZIF-8的成功合成、羽扇豆醇的有效封装以及HA的成功表面修饰。体外释放实验显示，该系统在模拟纤维化酸性环境（pH 5.8）中，羽扇豆醇的累积释放量约为中性环境（pH 7.4）下的4倍，表现出显著的pH响应性释放特性。
3.2. HA/Lupeol@ZIF-8的生物相容性研究
细胞毒性实验表明，HA/Lupeol@ZIF-8对活化的肝星状细胞（aHSCs）具有选择性毒性，而对静息态肝星状细胞和正常肝细胞的毒性较低。溶血实验证实其具有良好的血液相容性。
3.3. HA/Lupeol@ZIF-8的体外细胞摄取
细胞摄取实验显示，经HA修饰的纳米颗粒（HA/Cou6@ZIF-8）在CD44高表达的HSC-T6和LX-2细胞中，荧光信号显著强于未修饰组（Cou6@ZIF-8）和游离染料组。而在CD44阴性的AML-12细胞中则无此差异。用游离HA预处理细胞可竞争性抑制其摄取，证实了摄取是通过HA-CD44受体介导的。机制研究表明，其内吞主要依赖于小窝蛋白介导的内存作用，并且纳米颗粒能够有效地实现溶酶体逃逸。
3.4. NR标记的ZIF-8在正常和纤维化小鼠体内的分布
小动物活体成像显示，在肝纤维化小鼠中，HA/NR@ZIF-8在肝脏的蓄积显著高于未修饰的NR@ZIF-8和游离NR，且在注射后6小时达到峰值。而在健康小鼠中，各组间肝脏蓄积无显著差异。离体器官成像进一步证实了HA修饰纳米颗粒在纤维化肝脏的特异性富集。
3.5. 肝纤维化小鼠模型肝切片的免疫荧光染色
肝组织免疫荧光共定位分析显示，HA/NR@ZIF-8纳米颗粒（红色荧光）与aHSCs标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，绿色荧光）及CD44受体（黄色荧光）在纤维化肝组织内高度共定位，直观证明了其精准靶向aHSCs的能力。
3.6. HA/Lupeol@ZIF-8的体外治疗效果研究
Western blot结果表明，HA/Lupeol@ZIF-8能显著抑制TGF-β1诱导的aHSCs中纤维化标志物α-SMA和I型胶原（Collagen I）的表达。细胞划痕实验证实其能有效抑制aHSCs的迁移。此外，该纳米系统还能降低aHSCs内的活性氧（ROS）水平，并诱导细胞凋亡。代谢研究表明，HA/Lupeol@ZIF-8及其释放的Zn2+可抑制aHSCs的糖酵解过程，表现为乳酸脱氢酶（LDH）活性、乳酸及ATP含量的下降。
3.7. 生物安全性评估
对健康小鼠的血清生化指标（ALT、AST、BUN、CRE）检测及主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色病理学分析表明，HA/Lupeol@ZIF-8在治疗剂量下未引起明显的肝肾功能损伤或组织病理学改变，显示出良好的体内生物安全性。
3.8. HA/Lupeol@ZIF-8的体内抗纤维化效应
在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中，HA/Lupeol@ZIF-8治疗能显著改善小鼠的一般状态，降低肝指数和脾指数。血清学检测显示，它能有效降低模型小鼠血清中升高的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）和羟脯氨酸（HYP）水平。肝脏组织病理学染色（H&E、天狼星红、Masson）显示，HA/Lupeol@ZIF-8治疗组小鼠肝脏的炎症浸润、胶原纤维沉积和纤维间隔形成均得到明显改善。免疫组化显示α-SMA和CD44的表达也被显著抑制。Western blot分析进一步证实，HA/Lupeol@ZIF-8能上调肝组织中FXR和SHP的蛋白表达，同时调控下游与胆汁酸、脂质代谢相关的蛋白（如BSEP、SREBP-1c等），表明其通过激活FXR-SHP通路发挥抗纤维化作用。
综上所述，本研究成功构建了一种兼具CD44主动靶向和pH响应性药物释放双重功能的纳米递送系统HA/Lupeol@ZIF-8。该系统巧妙地克服了羽扇豆醇自身成药性差的瓶颈，通过精准靶向递送，在肝纤维化病灶处实现智能释药。体内外实验充分证明，HA/Lupeol@ZIF-8不仅能高效被aHSCs摄取，抑制其活化、迁移和ECM分泌，还能通过激活FXR-SHP信号通路、释放Zn2+抑制糖酵解、减轻氧化应激和诱导凋亡等多重机制协同发挥抗肝纤维化作用。这项研究不仅为羽扇豆醇的临床应用提供了可行的递送策略，也深化了人们对FXR-SHP通路在肝纤维化中保护作用的认识，为肝纤维化的靶向治疗提供了新的思路和实验依据，具有重要的转化医学潜力。
