《Microchemical Journal》：Hairpin-structured DNA-triggered isothermal cascade amplification for highly sensitive detection of DNA hydroxymethylation
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甲基化酶（M.HhaI）催化5hmC衍生双链DNA与发夹状DNA探针结合，触发级联等温扩增，实现0.78 fM超灵敏检测，适用于微量核酸样本（如血液、尿液）的癌症早期诊断与预后评估。
陈雪莲|高静文|任茹冰|白杰|辛雪莲|马雷|李翠萍
中国河北省公共健康安全重点实验室，河北大学公共卫生学院，教育部药物化学与分子诊断重点实验室，保定071002
摘要
5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）被誉为“第六种碱基”，已成为癌症诊断和预后的表观遗传生物标志物。对其敏感且快速的定量至关重要。本文建立了一种基于M.HhaI甲基转移酶催化的发夹结构DNA连接反应的5hmC级联扩增策略，随后通过等温级联扩增实现检测。M.HhaI甲基转移酶将半胱胺的巯基引入5hmC的羟基位置，生成氨基衍生的5hmC双链DNA（NH?-dsDNA）。5′-羧基修饰的发夹结构DNA（5′-COOH-HP-DNA）通过酰胺缩合反应与NH?-dsDNA共价连接，形成复合DNA（5hmC-dsDNA+HP-DNA）。HP-DNA含有不完整的Nt.Bst NBI内切酶识别位点和5′端突出序列。Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶从复合DNA的3′端开始延伸，生成可被切割的完整识别序列。聚合酶继续在切口处延伸，置换下游片段；重复的聚合-切割循环产生用于线性扩增的DNA片段（X）。X随后与X′-X′结构的扩增模板杂交，聚合酶和内切酶共同作用，进一步扩增产生更多X，实现指数级扩增。该策略的线性检测范围为1 fM至10 pM，检测限低至0.78 fM。该方法仅需皮克级DNA输入即可用于组织样本分析，适用于血液、尿液和脑脊液等微量核酸样本。该方法具有时间效率高、操作简单且不受序列或位点限制的优点，具有很高的实用性和便利性。
引言
5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）作为哺乳动物DNA中的“第六种碱基”，通过十十一转座（TET）家族蛋白的催化作用从5-甲基胞嘧啶（5mC）转化而来[1] [2]。它是活性DNA去甲基化途径中的中间产物，也是一种独特的表观遗传标记。越来越多的证据表明5hmC在多种生物过程中发挥作用，从胚胎发育到肿瘤发生[3] [4]。研究人员观察到，在多种恶性肿瘤的早期阶段，5hmC水平普遍下降[5] [6]，包括血液系统恶性肿瘤和实体瘤（如肺癌、结直肠癌、甲状腺癌[7]、胰腺癌[8]等）。此外，5hmC水平与癌症预后相关，成为有前景的预后生物标志物[9]。因此，灵敏地检测5hmC为表观遗传模式研究、早期疾病诊断和预后提供了有力工具。
5hmC的检测面临重大技术挑战。首先，5hmC与其母体碱基胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（5mC）共存，它们的化学结构非常相似——5hmC仅比C多一个-CH?OH基团，比5mC多一个-OH基团。其次，C和5mC的丰度远高于5hmC，5hmC的浓度通常仅为C的1/1000至1/10000，5mC的1/10至1/100[3]。这些生化限制要求开发超灵敏和特异性的检测方法以实现可靠的5hmC定量。
传统的5hmC检测方法主要依赖于液相色谱-串联质谱（HPLC-MS）[10] [11]、抗体依赖性免疫测定[12] [13]和亚硫酸盐辅助测序技术[14]。HPLC-MS被认为是精确检测5hmC的金标准，但需要昂贵的仪器、耗时的样本预处理、技术娴熟的操作人员以及微克级DNA输入。免疫测定（如Dot blot）需要复杂的实验流程和昂贵的抗体，其灵敏度和特异性与抗体的亲和力和选择性密切相关。基于亚硫酸盐的测序技术虽然可以实现5hmC的位点特异性定量，但操作繁琐且耗时，实验成本较高。
新兴的5hmC检测方法主要依赖于 potassium perruthenate (KRuO?)[15] [16] [17]或peroxotungstate[18] [19]诱导的氧化作用，以及T4噬菌体β-葡萄糖转移酶（β-GT）的糖基化作用[20]。氧化依赖性方法仅限于5hmC的位点特异性检测。值得注意的是，氧化过程可能导致不可逆的DNA链断裂，从而影响基因组的完整性和后续分析的有效性。糖基化方法需要先进行糖基化步骤，然后使用尿苷二磷酸-6-叠氮葡萄糖（UDP-N?-Glu）作为底物，通过点击化学将荧光标签[20]、生物素标签[21]或DNA链[22] [23] [24]共价连接；或者使用尿苷二磷酸-葡萄糖（UDP-Glu）与功能化硼酸基团[25] [26]结合。糖基化步骤耗时2–24小时，限制了检测速度。此外，使用UDP-N?-Glu作为底物会增加检测成本。
M.HhaI甲基转移酶（MTase）可催化5hmC残基上的巯基到羟基的特异性取代[27]。利用这一酶活性，研究人员开发了多种5hmC检测平台，主要采用电化学发光（ECL）[28] [29] [30]或光电化学（PEC）[31] [32]信号转导机制，用于双链DNA（dsDNA）和单核苷酸形式（5hm-dCTP）的检测。M.HhaI MTase可在1–2小时内完成5hmC的催化取代，且不需要昂贵底物，是一种时间和资源高效的5hmC检测方法。荧光方法因高灵敏度和特异性以及操作简便性而受到广泛关注，但基于M.HhaI MTase的荧光检测方法仍较为少见。
等温指数扩增反应（EXPAR）因其快速动力学和简单设计而受到关注[33]。该系统使用一种特殊设计的模板DNA，其中包含两个重复序列（X′-X′），由一个用于切割内切酶的短识别位点分隔。当单链DNA触发序列（X）与模板的互补重复序列杂交时，扩增过程开始。通过DNA聚合酶介导的延伸和随后由切割内切酶进行的切割，每个循环生成一个新的触发DNA（X）拷贝。生成的X也会与模板杂交，从而形成更多的X。该机制可实现短单链DNA片段的指数级扩增，半小时内扩增效率可达10^6–10^9倍[34]。等温扩增系统无需热循环，已广泛应用于DNA和microRNA定量[35]、酶活性监测[36]、病毒病原体鉴定[37]以及表观遗传修饰分析（特别是DNA甲基化和羟甲基化修饰[38]）。
本文提出了一种新型的高灵敏度5hmC检测策略，利用M.HhaI甲基转移酶（MTase）催化的发夹结构DNA（HP-DNA）连接反应和随后的HP-DNA驱动的等温级联扩增。M.HhaI MTase将5hmC上的羟基替换为半胱胺的巯基，生成氨基衍生的5hmC。随后，氨基衍生的5hmC与羧基修饰的HP-DNA探针共价连接，形成复合DNA，从而在5hmC位点标记HP-DNA探针。复合DNA中的HP-DNA随后引发线性至指数级扩增（EXPAR）。与传统EXPAR不同，连接的HP-DDNA首先引发线性扩增，然后生成的DNA作为引物驱动指数级扩增，从而实现更高的扩增效率。级联扩增反应实现了5hmC的超灵敏检测。在没有5hmC的情况下，氨基衍生和HP-DNA连接均无法发生，因此不会触发后续的级联扩增。该荧光生物传感器具有序列独立性，可应用于检测各种小鼠组织中的5hmC。
氨基衍生的5hmC-dsDNA和复合DNA的制备
将含有5hmC位点的5 μM单链DNA（ssDNA）及其互补DNA（5 μM）在1×杂交缓冲液（100 mM Tris、10 mM EDTA、100 mM NaCl，pH 8.0）中于95°C孵育5分钟，然后在SimpliAmp热循环仪（Applied Biosystems，美国）中冷却至室温，得到双链DNA（5hmC-dsDNA，5 μM）。将14 μM ssDNA在1×杂交缓冲液中于95°C加热5分钟，然后缓慢冷却至室温。
5hmC检测原理
本研究开发了一种基于M.HhaI MTase催化的发夹DNA连接反应和随后的级联扩增的5hmC检测策略。检测过程包括两个模块：(i) M.HhaI MTase催化的发夹DNA探针特异性连接；(ii) 聚合酶和切割酶驱动的线性扩增以及随后的EXPAR基指数信号增强，如图1a所示。
结论
本文提出了一种基于M.HhaI MTase催化的发夹结构DNA连接反应和随后的级联扩增的5hmC灵敏检测新方法。该方法具有多个优势：(1) 利用M.HhaI MTase的选择性催化作用，只有5hmC上的羟基能与HP-DNA连接，避免C和5mC的干扰，确保高特异性；(2) 在5hmC位点连接的HP-DNA引发级联扩增。
CRediT作者贡献声明
陈雪莲：撰写 – 原始草稿、软件开发、数据分析、概念构思。高静文：验证、数据分析、数据管理。任茹冰：数据分析。白杰：撰写 – 审稿与编辑、资源协调。辛雪莲：撰写 – 审稿与编辑、资源协调。马雷：撰写 – 审稿与编辑、资金筹集。李翠萍：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、监督、资源协调、方法设计、资金筹集。
资助
该项目得到了河北省自然科学基金（C2023201049）、国家自然科学基金（21707027）以及河北省引进海外学者资助计划（C20230309）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
