可编程激活的自维持AND门控DNA四面体纳米装置，用于双生物标志物触发成像和协同基因治疗

《Microchemical Journal》：Programmable activation of a self-sustaining AND-gated DNA tetrahedral nanodevice for dual-biomarker-triggered imaging and synergistic gene therapy

基于miRNA-21和APE1双输入的AND逻辑门自持DNA四面体纳米装置实现肿瘤细胞特异性成像与siRNA递送治疗。

霍春园|孟彦玲|郭志强|孟双宇|马润龙|于文通|赵子彦|李宝文|任新如|张海平|刘苏|黄家东|王宇

摘要

癌症导致的高死亡率是全球主要的健康挑战之一，主要归因于晚期诊断和缺乏有效的治疗干预措施。传统的诊断方法依赖于单一生物标志物，但由于肿瘤的固有异质性，这些方法往往缺乏足够的特异性来准确检测肿瘤。为了克服诊断准确性和药物递送的非特异性问题，我们开发了一种AND门控的、自维持的DNA四面体纳米装置（aDTN），该装置通过AS1411适配体介导的主动识别实现肿瘤细胞特异性靶向。该纳米装置包含一个双输入逻辑系统，能够响应微小RNA（miRNA）和脱嘌呤/脱嘧啶内切酶1（APE1），从而实现高保真成像和程序性死亡配体1（PD-L1 siRNA）的时空可控释放，最终诱导癌细胞凋亡。这种多功能aDTN通过自维持的趾握机制（TMSD）运作，随后在miR-21和APE1共同存在的情况下激活别构DNA酶。这种设计确保仅在目标肿瘤细胞内选择性激活，从而提高细胞成像的特异性并最小化脱靶效应。体外实验表明，aDTN能够利用不同的生物标志物特征准确区分乳腺癌细胞（MCF-7）和正常细胞，诱导浓度依赖性的细胞毒性，并有效抑制PD-L1蛋白表达，从而促进凋亡，同时在非目标细胞中保持高生物相容性。总体而言，智能aDTN平台为癌症的精准诊断和协同基因治疗提供了一种强大而整合的策略，为治疗性纳米医学开辟了有前景的方向。

引言

癌症已成为全球主要的死亡原因和公共卫生挑战，这主要归因于晚期发现、预后不良以及有效治疗干预措施的缺乏[1]、[2]。早期和精准的诊断结合及时有效的治疗可以显著提高患者的生存率。目前，细胞内生物标志物的可视化成像已成为肿瘤早期诊断和治疗的一种非常有前景的技术[3]，因为生物标志物与癌症的发生和发展密切相关[4]。微小RNA（miRNA）是一类短的非编码寡核苷酸，在细胞内基因表达的转录后调控中起着关键作用。miRNA表达水平的失调与肿瘤的预后、进展和复发密切相关[5]。APE1是一种多功能蛋白质，其主要功能是作为DNA修复核酸酶，可以切割AP位点旁边的磷酸二酯键[6]。APE1在正常细胞中主要存在于细胞核中，但在肿瘤细胞中同时存在于细胞核和细胞质中[7]。然而，只有少数生物标志物具有足够的特异性和敏感性，可以单独用于癌症诊断[8]，因为肿瘤的发展涉及具有高异质性和动态多样性的复杂分子网络。因此，单一标志物的检测不足以实现高置信度的诊断，并且容易产生假阳性结果[9]、[10]。使用多种生物标志物可以显著提高诊断准确性，并提供更全面的肿瘤异质性表征[11]。因此，利用多种生物标志物进行细胞内生物分子成像可以实现更全面和准确的诊断评估，从而显著提高临床决策和预后评估。核酸信号放大对于提高分子诊断的敏感性至关重要。这些策略通常分为酶辅助方法，如滚环扩增（RCA）和链置换扩增（SDA），以及无酶方法，包括催化发夹组装（CHA）、杂交链反应（HCR）、DNA酶催化和熵驱动电路。其中，无酶系统因其温和的反应条件、灵活的设计和优异的生物相容性而受到特别关注[12]、[13]。基于这些进展，开发出将精确生物标志物识别与治疗功能相结合的智能无酶扩增系统，对于下一代癌症治疗性纳米医学具有巨大潜力。

RNA干扰（RNAi）是一种强大的生物技术，在肿瘤治疗中具有显著潜力，它通过特异性降解或抑制目标mRNA来抑制相应基因的表达[14]。然而，siRNA的递送仍然面临几个关键挑战，包括易受核酸酶降解、细胞摄取效率低以及内体/溶酶体逃逸能力差等问题，这些都阻碍了其临床应用[15]。目前，已经设计了多种纳米药物递送系统以实现靶向药物递送和可控释放，从而提高治疗效果[16]。其中，四面体DNA纳米结构（TDNs）因其独特的空间可寻址性、高可编程性和出色的细胞穿透能力而受到广泛关注[17]。研究人员越来越多地使用TDNs作为针对肿瘤相关基因的siRNA载体[18]、[19]。例如，高等人设计了一种用于siRNA封装的四面体框架核酸纳米盒[20]，而陈等人开发了一种可编程的DNA-RNA四面体纳米笼（TDRN），用于多柔比星和P-糖蛋白（P-gp）siRNA的共同递送[21]。然而，大多数刺激响应递送系统依赖于单一标志物触发机制，这降低了siRNA递送的精度并增加了脱靶毒性的风险[22]。因此，开发一种能够同时最小化siRNA过早泄漏和减少脱靶毒性的成像引导的多刺激响应递送平台仍然是一个重大挑战。

逻辑门控源自电路设计，通常称为布尔逻辑，代表了执行布尔运算的基本计算单元[23]。由于DNA基逻辑门具有固有的可编程性、高生物相容性和序列特异性预测性，它们已被整合到递送系统中，以实现刺激响应的成像和可控药物释放[24]。早期的逻辑门控纳米载体通过检测单一分子输入来执行YES/NO操作[25]，但这些系统无法抑制高背景信号和脱靶激活[26]。相比之下，AND门控框架可以在需要多个肿瘤相关标志物同时存在的条件下启动成像或治疗反应，从而显著提高诊断和治疗的可靠性[27]。例如，张等人构建了一种由miR-21和APE1共同存在选择性激活的内源性AND逻辑DNA纳米机器（EDN）[28]。李等人开发了一种使用miR-21和miR-155作为双重输入的模块化DNA逻辑门系统，用于调节药物释放和光热反应[29]。然而，这些系统由于消耗的刺激物不可回收而无法持续提供输入。因此，构建一个能够持续提供输入并实现成像介导的治疗整合的可重构集成电路仍然是一个紧迫的挑战。

在这里，构建了aDTN，用于细胞内miRNA/APE1的可视化成像和PD-L1 siRNA的时空可控递送，以实现协同基因治疗。这种多功能aDTN通过别构DNA酶设计，将基于“AND”逻辑门电路的高保真成像模块与靶向药物递送模块结合在一个平台上，实现了信号转导和时空可控药物释放的整合。这与之前报道的仅限于单步检测的miR-21/APE1响应纳米装置不同，真正实现了协同治疗整合。该aDTN通过AND门控的TMSD级联扩增和别构DNA酶的激活来运作，由可编程的AND门控电路精确调控，从而实现细胞内miRNA/APE1的高保真成像，并通过时空可控的PD-L1 siRNA释放促进成像引导的基因治疗。此外，AS1411适配体的整合赋予了aDTN主动靶向肿瘤的能力，有助于选择性地内化到核仁过表达的癌细胞中，从而提高治疗效果并最小化脱靶效应。总体而言，智能aDTN平台为癌症的精准诊断和靶向治疗提供了强大而整合的策略，为治疗性纳米医学开辟了有前景的方向。

章节片段

aDTN的自组装

寡核苷酸S1、S2、S3和S4以等摩尔比（200 nM）混合在TAE/Mg²⁺缓冲液中（40 mM Tris、2 mM EDTA、20 mM 醋酸、12.5 mM Mg(OAc)?，pH 8.0）。溶液在95°C下孵育5分钟，然后自然冷却至4°C以获得自组装的DNA四面体纳米结构（DT）[30]。随后将RA1和RA2以等摩尔比与DT结合，并在25°C下孵育1小时，以获得用RA1和RA2功能化的DTN。最后，加入无活性的DNA酶和PD-L1 siRNA

AND门控自维持DNA四面体纳米装置（aDTN）的原理

如图1所示，智能aDTN是通过修改DNA四面体（DT）顶点的四个臂来制造的，其中包括用于靶向核仁的AS1411适配体臂（AS1411 Apt），从而促进aDTN的渗透和摄取；两个用于检测miRNA-21和APE1的识别臂（RAs）；以及一个用于实现可视化成像和PD-L1 siRNA递送的别构DNA酶辅助指示臂（IA）。

结论

总之，开发了一种AND门控的自维持DNA四面体纳米装置（aDTN），作为一个集成的治疗平台。该系统基于一个双输入逻辑电路，由细胞内生物标志物miR-21和APE1的同时存在特异性激活。激活后，它触发一个自维持的趾握机制（TMSD）级联反应，导致DNA酶活性的放大恢复，从而实现高保真

CRediT作者贡献声明

霍春园：撰写——原始草稿、方法学、数据管理。孟彦玲：项目管理。郭志强：软件、形式分析。孟双宇：数据管理。马润龙：软件、形式分析。于文通：数据管理。赵子彦：数据管理。李宝文：方法学。任新如：软件、形式分析。张海平：软件、形式分析。刘苏：撰写——审阅与编辑、方法学。黄家东：撰写——审阅与编辑、方法学、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（32072330）、山东省自然科学基金（ZR2024MC007）、山东省自然科学基金（ZR2022MB066）以及济南市-高校合作发展战略项目（JNSX2024027）的支持。