《Microchemical Journal》：Ultrasensitive detection of tumor marker CA15–3 using a CRISPR/Cas12a-assisted CdTe QDs@ZIF-8 dual-emission fluorescence sensor
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CA15–3检测平台开发：基于CdTe量子点/ZIF-8纳米复合材料的CRISPR/Cas12a-CHA双信号系统，实现0.131 U/mL超低检测限，通过内参信号提升结果可靠性。
段毅|刘梅琳|门电辉|罗一瑶|夏旭辉|王莉|邓飞|霍丹群|侯长军
教育部生物流变科学与技术重点实验室，重庆大学生物工程学院，中国重庆400044
摘要
CA15–3是监测和评估乳腺癌患者治疗效果的重要生物标志物，尤其是对于晚期患者而言。传统的免疫测定方法存在局限性，包括成本高昂、灵敏度有限以及依赖于可能出错的单一荧光信号输出。为了解决这些问题，我们设计了一种基于CdTe量子点@ZIF-8纳米材料的双信号发射传感器，结合了CRISPR/Cas12a系统和催化发夹组装（CHA）技术。CA15–3与其特异性适配体的结合会抑制CHA级联反应，从而阻止产生启动Cas12a介导的转切裂活动所需的双链DNA激活剂。结果，FAM-ssDNA大量吸附在CdTe QDs@ZIF-8表面，有效的电子转移使其荧光被抑制。适配体的加入通过CHA和CRISPR/Cas12a系统实现了双信号放大，检测限达到0.131?U/mL。这种双信号输出机制为系统提供了内部参考功能，显著提高了结果的可靠性。总体而言，这项工作建立了一个新型肿瘤生物标志物检测平台，兼具高灵敏度和出色的稳健性。
引言
乳腺癌被公认为对女性健康的主要威胁，其流行病学特征和控制策略已成为公共卫生讨论的焦点。根据美国癌症协会（ACS）的最新流行病学数据，乳腺癌在影响美国女性的恶性肿瘤中发病率和死亡率均较高。预计到2025年，它将占新诊断女性癌症的32%，成为女性癌症相关死亡的第二大原因，死亡比例为14% [1]。CA15–3是一种广泛使用的巨分子糖蛋白生物标志物，是MUC1外域（MUC1-N）的异常糖基化片段，由癌细胞释放到血液中 [2]，[3]，[4]。在正常生理条件下，MUC1是一种普遍表达的跨膜黏蛋白，会经历广泛的糖基化，从而掩盖CA15–3表位并阻碍其检测。它主要具有保护功能，包括形成细胞屏障、提供润滑和维持水分。然而，在乳腺癌等恶性肿瘤中，MUC1过度表达，并且其糖基化模式发生显著病理变化，导致先前被屏蔽的表位暴露。这些变化使得炎症激活的蛋白酶能够特异性切割，将MUC1-N释放到血液中，产生可检测的CA15–3抗原 [5]，[6]，[7]，[8]，[9]。这一系列癌症特异性分子事件使得CA15–3成为诊断和管理乳腺癌的关键且广泛采用的血清学生物标志物。在健康个体中，血清CA15–3浓度通常低于25?U/mL。但在30%至50%的乳腺癌患者中，CA15–3水平可能超过100?U/mL，其波动紧密反映了肿瘤负担和治疗反应。这为监测术后复发和评估乳腺癌患者的转移风险提供了宝贵的参考 [10]，[11]，[12]。因此，开发高度敏感和特异的分析方法以准确监测血清CA15–3浓度的动态变化至关重要。
现有的CA15–3定量检测方法——如荧光传感器 [13]，[14]、电化学传感器 [15]，[16]、电化学发光生物传感器 [17]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[18] 和侧向流动免疫测定（LFA）[19]——主要基于抗原-抗体识别。虽然这种方法应用广泛，但由于抗体稳定性差、修改困难以及生产成本高，其实际应用受到限制 [20]，[21]。适配体是一类新型寡核苷酸序列，相比传统抗体具有多个优势，包括易于合成和修改、优异的物理化学稳定性、通过分子设计灵活添加标记位点，以及对目标的高选择性和结合亲和力。适配体已成功集成到多种分析物的检测平台中 [20]，[22]，[23]。值得注意的是，由于其核酸组成，适配体不仅可以作为识别元件，还可以作为核酸扩增反应的引物或分子反应的触发器。这一特性使它们能够无缝集成到下一代基于核酸的扩增技术中。
在各种新兴技术中，CRISPR–Cas系统（成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白）因其独特的机制而脱颖而出。该系统最初来源于微生物中的RNA引导的适应性免疫系统，现已发展成为一种具有卓越特异性的可编程基因识别工具，开启了基因组编辑的新时代。此外，它在生物传感应用中展现出巨大潜力 [24]，[25]。特别是Cas12a（Cpf1）是一种独特的RNA引导的DNA内切酶 [26]。与其他Cas蛋白不同，Cas12a既能识别双链DNA（dsDNA）也能识别单链DNA（ssDNA），并表现出强大的转切裂活性：在特定目标结合后，它会被激活并无差别地切割周围的非目标ssDNA分子 [27]，[28]，[29]。这一特性使得单个识别事件能够转化为显著放大的信号。然而，要准确量化低丰度目标并覆盖广泛的动态范围，通常需要在CRISPR–Cas系统中加入预扩增步骤。CHA是一种依赖于趾架介导的链位移的信号放大策略。它利用目标核酸作为催化剂，启动两个专门设计为形成稳定二级结构的互补DNA发夹之间的级联反应 [30]。在初始状态下，发夹的活性域被封闭在茎部，防止自发杂交。当与一个发夹的趾架区域结合时，目标核酸使其打开并暴露新的序列，然后与第二发夹发生链位移，形成稳定的双链复合物 [31]，[32]。目标核酸保持完整，可以反复催化反应，从而实现高效的信号放大。作为一种仅依赖于发夹DNA探针设计的等温信号放大方法——无需酶或热循环——CHA因其简单性、灵敏度和成本效益而成为有吸引力的选择 [33]，[34]。
例如，Xu等人 [35] 开发了一种无标记荧光适配体传感器，利用CRISPR/Cas12a系统超灵敏地检测黄曲霉素B1（AFB1）。该方法结合了适配体识别、基于CHA的信号放大和G-四链体增强的荧光，实现了0.001–50?ng/mL的宽线性动态范围和低至0.84?pg/mL的检测限，同时在真实食品样本中表现出优异的选择性、稳定性和回收率。在另一项研究中，Liu等人 [32] 利用CHA和CRISPR/Cas12a的协同效应开发了一种高灵敏度的AFB1检测方法。在AFB1存在下，适配体结合引发CHA级联反应，产生大量的dsDNA。生成的dsDNA激活Cas12a的转切裂活性，无差别地切割荧光探针并产生显著放大的荧光信号。这种放大策略实现了50 pM至1?nM的宽线性范围和10 pM的检测限，为食品中微量AFB1的快速准确定量建立了新平台。
这些研究共同展示了适配体–CHA–CRISPR级联策略在扩展检测范围和降低检测限方面的显著优势。然而，大多数当前的基于CRISPR的检测系统仍然仅依赖单色荧光探针进行信号输出。尽管这种方法具有宽动态范围、准确定量和快速响应等优点，但其单信号输出容易受到探针浓度和仪器变化等非目标因素的干扰。相比之下，双信号检测策略结合了内部参考信号，实现了更稳健的输出格式，有助于识别和减少系统误差，从而提高检测结果的可靠性和准确性 [36]，[37]。
功能性纳米材料的引入为构建稳定、高效且光谱可区分的双发射信号源提供了有效策略。金属有机框架（MOF）是通过金属簇和多功能有机配体之间的协调驱动自组装形成的晶体多孔结构 [38]。一个典型的例子是ZIF-8，它由锌离子节点与2-甲基咪唑连接剂组成。其温和、可控的合成条件和超高的比表面积赋予了出色的表面吸附能力和高效的荧光抑制性能 [39]，[40]。Yang等人 [41] 开发了一种基于CdS@ZIF-8纳米材料的双信号传感策略。ZIF-8框架具有高比表面积和正表面电荷，能有效吸附带负电的FAM标记的ssDNA探针，通过能量或电子转移机制在520?nm处抑制FAM的绿色荧光。同时，封装在ZIF-8空腔内的红色发光碳点在665?nm处提供稳定的内部参考信号。这种方法证明了使用CdS@ZIF-8的双荧光特性实现双信号输出的可行性，并为设计更稳健的CA15–3检测生物传感平台提供了有价值的指导。
在此基础上，我们开发了一种双发射荧光生物传感平台，结合了适配体识别、CHA信号放大和Cas12a介导的切割，利用双功能CdTe QDs@ZIF-8纳米复合材料对肿瘤生物标志物CA15–3进行高灵敏度定量。在CA15–3存在下，其与适配体的特异性结合会干扰CHA级联反应，从而抑制dsDNA的生成并阻止Cas12a的转切裂活性。在这种情况下，未切割的FAM-ssDNA探针通过静电吸附在带正电的ZIF-8表面，其在520?nm处的荧光通过电子转移被MOF有效抑制。同时，封装在ZIF-8空腔内的CdTe QDs持续在640?nm处发出稳定的红色荧光，作为内部参考信号以确保系统的有效性。实时监测FAM信号与CdTe参考信号之间的荧光比率，可以精确检测探针的切割状态，从而准确量化CA15–3浓度。因此，这项工作建立了一种可靠且灵敏的双发射荧光检测策略。通过结合CdTe QDs的稳定荧光作为内部参考和响应性的FAM信号，双通道输出模式显著提高了检测的稳健性和可靠性。这一策略为高性能CA15–3分析提供了新的范例，并极大地推动了肿瘤生物标志物传感技术的发展。
试剂和材料
硼氢化钠和甲醇购自成都凯世化工有限公司。2-甲基咪唑、氢氧化钠、亚碲酸钠和三钠柠檬酸二水合物（CA）购自上海阿拉丁公司。六水合硝酸锌和无水3-巯基丙酸（MPA）乙醇购自川东化工集团。LbCas12a酶购自广州美加生物科技有限公司，并存储在?20?°C。氯化镉购自...
CRISPR/Cas12a驱动的CdTe QDs@ZIF-8双发射荧光传感器
本研究的核心创新是成功设计和合成了CdTe QDs@ZIF-8纳米复合材料。这种复合材料结合了CdTe QDs的优异荧光性能以及ZIF-8的高表面积、有序孔结构和化学稳定性。采用了一种简单、温和且快速的共沉淀方法，其中Zn2+前体、预先合成的CdTe QDs和2-甲基咪唑配体在甲醇中混合，以促进ZIF-8的原位生长和封装
结论
本研究提出了一种使用CdTe QDs@ZIF-8纳米复合材料的新双发射荧光传感平台，用于超灵敏和特异性检测肿瘤生物标志物CA15–3。核心创新在于CdTe QDs@ZIF-8结构所提供的独特“动态抑制开关”机制。ZIF-8外壳不仅保护了封装的CdTe QDs，维持了稳定的内部参考荧光信号，还利用其分子筛分特性
CRediT作者贡献声明
段毅：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理。刘梅琳：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，验证，概念化。门电辉：研究。罗一瑶：研究。夏旭辉：研究。王莉：研究。邓飞：监督。霍丹群：监督。侯长军：监督，资金获取。
利益冲突声明
作者声明与本研究、作者身份或文章发表无关的潜在利益冲突。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：81772290）和四川省科技支持计划（编号：2022YFSY0013）的支持。作者为成都-重庆经济圈内大学的访问学者。感谢重庆大学分析测试中心（SEM / TEM / FT-IR表征）以及重庆大学大型设备的共享支持。
