《Molecular Genetics and Metabolism》：Development of a quantitative real-time PCR-based newborn screening system for citrin deficiency using dried blood spots
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为解决新生儿筛查中柑氨酸缺乏症（Citrin Deficiency）传统代谢物检测灵敏度不足的难题，日本熊本大学等机构研究人员开展了一项基于定量实时PCR（qPCR）技术的新型筛查方法研究。该方法以干血斑为样本，靶向检测SLC25A13基因的6个日本最常见致病变异，结果证明其可准确区分野生型、杂合子和纯合子，检测灵敏度高。此研究建立了一个低成本、快速、可靠的筛查体系，有望显著提高该病的早期检出率，实现早期干预，改善患者预后。
在生命早期，一种名为柑氨酸缺乏症（Citrin Deficiency）的隐性遗传代谢病，正悄然影响着部分新生儿的健康。这种疾病源于SLC25A13基因的突变，导致一种名为“柑氨酸”的线粒体内膜转运蛋白功能丧失。作为一种苹果酸-天冬氨酸穿梭的关键组分，柑氨酸的缺陷会扰动包括糖酵解、糖异生、de novo脂质合成、β-氧化、三羧酸循环和尿素循环在内的多条关键代谢通路，进而引发一系列与年龄相关的复杂临床表现。患者可能在新生儿期就表现出以肝内胆汁淤积为特征的NICCD（柑氨酸缺乏所致新生儿肝内胆汁淤积症），症状可随年龄增长自发缓解，但部分会进入无症状的“代偿期”，甚至最终进展为以严重高氨血症、瓜氨酸血症、脂肪肝、神经认知障碍为特点的AACD（青少年及成人期柑氨酸缺乏症，原称Ⅱ型成人瓜氨酸血症），严重影响生存质量，甚至危及生命。
早期诊断和干预是改善患儿预后的关键。然而，传统的基于干血斑（DBS）的串联质谱新生儿筛查（NBS），即便结合了瓜氨酸、精氨酸等多种代谢物标志物，其筛查灵敏度仍不理想，在日本的检出率仅约26%-66.7%，意味着大量患儿可能在未得到及时诊断的情况下，错失了最佳的干预窗口。为了填补这一筛查“漏洞”，让更多患儿在疾病“引爆”前被精准识别，一项由日本熊本大学等机构的研究团队开展的研究，将目光投向了疾病的遗传根源。他们设想，能否像“缉拿”特定嫌疑人一样，直接在新生儿出生后采集的几滴干血斑中，快速、准确地筛查出导致柑氨酸缺乏症最常见的几个“罪魁祸首”——SLC25A13基因的致病变异？这不仅是一个技术挑战，更关乎无数家庭和患儿的未来。
为了验证这一构想，研究人员设计并建立了一套基于定量实时聚合酶链式反应（qPCR）的筛查体系。该研究巧妙结合了两种主流检测技术：针对c.674C>A、c.852_855delTATG、c.1177+1G>A、c.1311+1G>A这4个点突变或小缺失，采用了商品化的TaqMan?探针法SNP分型系统；而对于c.1638_1660dup和c.1750_1751[insNM_138459.3:2672_24;1750+72_1751-4dup]这两个大片段插入/重复变异，则自行设计了变异特异性引物，采用SYBR? Green染料法进行检测。研究选取了日本山口县2018年至2020年间出生的1055名健康新生儿（作为筛查队列）以及19名已知携带目标变异的患者（作为阳性对照）的干血斑样本，从单个直径3.2毫米的血斑打孔片中提取DNA，进行上述6个变异的高通量筛查，所有阳性结果均通过Sanger测序验证。
2.3. 变异筛查结果
在1055名健康新生儿中，研究人员共在19名婴儿中检出了杂合子变异，其中c.852_855delTATG 5例，c.1177+1G>A 13例，c.1311+1G>A 1例，而c.674C>A、c.1638_1660dup和IVS16ins3kb（即c.1750_1751[insNM_138459.3:2672_24;1750+72_1751-4dup]）未检出。由此计算出的总等位基因频率为0.009005，与日本基因组数据库jMorp中报告的频率高度一致，对应估算的携带者频率约为1/56（1.81%）。在19名已知患者样本中，该检测体系准确地识别出了所有致病等位基因的基因型。
2.4. 方法学验证与灵敏度
通过TaqMan?系统检测4个点突变/小缺失时，扩增曲线和等位基因区分图可清晰地将野生型、杂合子和纯合子样本区分开，如所示。对于两个大片段变异，虽然无法通过熔解曲线有效区分，但通过在不同反应孔中分别使用野生型引物和变异特异性引物进行平行扩增，可以可靠地检测出杂合子，如所示，表明该检测体系具有高度的准确性。
2.5. 成本与潜在覆盖率
研究人员估算，将此项qPCR筛查整合到现有NBS流程中，每个样本仅需额外增加约1350日元（约合人民币65元）的试剂成本。更重要的是，该体系所覆盖的6个变异，在日本的柑氨酸缺乏症患者中占所有致病等位基因的82.8%，在患者（基因型）层面的覆盖率达98.4%。这意味着，理论上仅有约1.6%的患者可能因携带罕见变异而漏检。该筛查策略在东亚其他国家也具有广泛的适用潜力，预计可覆盖越南患者约96.6%的等位基因，中国78.2%，韩国87.9%。
综上，本研究成功开发并验证了一套以新生儿干血斑为样本、基于qPCR技术的柑氨酸缺乏症靶向基因筛查体系。该体系兼具成本效益、快速、准确和可整合性等优点，能可靠检测SLC25A13基因在日本人群中最常见的6个致病变异。其重要意义在于，它有望从根本上解决传统代谢物筛查灵敏度不足的核心问题，将柑氨酸缺乏症的新生儿筛查从依赖不稳定的代谢“表象”，推进到锁定遗传“根源”的精准医学新阶段。通过在新生儿期实现大规模、高效率的基因筛查，能够将诊断关口大幅前移，使得绝大多数患儿在出现严重临床症状前就被识别，从而有机会尽早开始以饮食调整（如补充中链甘油三酯MCT）和密切监测为核心的干预管理。这不仅可能预防或延缓NICCD的急性发作，更能显著降低患儿未来进展为终末期肝病（AACD）的风险，从根本上改善其长期生活质量，减轻家庭与社会负担。这项研究成果为将靶向基因筛查整合进常规新生儿公共卫生项目提供了坚实的技术范式和可行性依据，标志着柑氨酸缺乏症防治策略向前迈出了关键一步。
