《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A dual-key fluorogenic probe for DNA and proteins imaging
via excimer disaggregation and viscosity-activated molecular rotor
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荧光探针CV-N3通过双响应机制实现DNA和蛋白的特异性活细胞成像，结合激发体解离（荧光由红转绿）和粘度激活的分子转子效应（荧光增强），验证了其高信噪比、低细胞毒性和动态追踪能力。
赵 王|钱 王|冯 孟祥|戴 方芳|马 思月|苗 青|王 林琳|陈 光
陕西科技大学化学与化学工程学院，陕西工业化学添加剂重点实验室，中国西安 710021
摘要
荧光成像在阐明生物分子动态方面起着关键作用，然而开发能够实现对多个目标进行特异性和高对比度成像的探针仍然具有挑战性。在此，我们设计并合成了一种新型的基于氰乙烯的荧光探针CV-N3，该探针结合了双响应机制：一种是激子解聚，另一种是受粘度激活的分子转子。激子形成及其通过CuAAC诱导的解聚过程通过动态光散射和时间分辨荧光寿命测量得到了直接验证。该探针能够通过铜催化的叠氮-炔烃环加成反应，在活细胞中对标记有炔烃的DNA和SNAP标签蛋白进行特异性共价标记，其标记特异性通过竞争性结合实验得到了进一步确认。在溶液中，我们验证了这种双机制：与目标的共价结合会触发激子解聚，使发射波长从约630纳米蓝移至535纳米；而生物大分子的受限局部微环境则激活了分子转子的特性，显著增强了荧光强度。因此，CV-N3能够在活细胞中对DNA和蛋白质实现高信噪比、无需洗涤的成像，并且具有良好的光稳定性和低细胞毒性。其用于动态细胞研究的实用性还通过追踪细胞更新和多色成像兼容性得到了进一步证明。这项工作为构建多响应探针提供了一种通用策略，为复杂生物系统中的多重生物分子成像和动态研究提供了一个有前景的平台。
引言
点击化学（Click chemistry）以其高反应效率和出色的生物正交性而闻名，已成为在活细胞中对各种生物大分子（如核酸和蛋白质）进行特异性标记和成像的强大工具[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。与传统的荧光标记方法（如使用小分子染料染色、抗体免疫荧光或荧光融合蛋白）相比，基于点击化学的荧光标记克服了几个限制：染料的特异性较差、抗体的膜渗透性低以及荧光蛋白体积较大[7]、[8]、[9]。此外，由于非酶促小分子功能团（例如叠氮/炔烃）的高生物相容性[10]、[11]、[12]，它显著减少了对生物系统的干扰。
激子是由两个相同的荧光分子在激发状态下通过π–π堆叠形成的瞬态二聚体[13]。其形成和荧光行为可以通过单体浓度、pH值、温度和溶剂极性等环境参数进行调节[14]。典型的激子形成分子包括芘和基于氰乙烯的染料[13]、[15]、[16]、[17]。其中，基于氰乙烯的染料是一类能够发出远红光（>630纳米）的独特激子[15]、[18]、[19]。它们的结构特征是一个π共轭的氰乙烯桥，将苯胺供体与苯并噻唑受体连接起来。Kim的研究小组证明，基于氰乙烯的染料在聚集状态下会形成面对面堆叠的二聚体，发出红色荧光（λem ≈ 630纳米），而解聚后的单体则发出绿色荧光（λem ≈ 535纳米），从而显示出明显的光谱变化[20]、[21]、[22]。随后，他们利用这一机制开发了基于激子的荧光探针，通过调节组装-解聚过程分别实现了对Caspase-3、白蛋白、磷脂酶D和线粒体DNA四螺旋结构的荧光检测[21]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。
除了激子特性外，我们还发现基于氰乙烯的染料还表现出D-π-A类型的分子转子特性。在激发状态下，单键的分子内旋转会导致分子内电荷转移（TICT）状态，从而引起有效的荧光淬灭[28]。相反，当旋转受到限制时——例如在高粘度微环境中或与生物大分子结合时——非辐射衰减减少，导致荧光显著增强[29]。这为实现各种生物大分子的低背景荧光成像提供了一个理想的平台。
在这里，我们开发了一种基于氰乙烯染料的叠氮功能化“双键”荧光探针CV-N3，该探针结合了激子解聚和受粘度激活的分子转子荧光的双重机制（见图1）。该探针能够通过铜催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）反应，实现对标记有末端炔烃的细胞内DNA和蛋白质的特异性共价标记和“无需洗涤”的荧光成像。用于DNA标记的是含有末端炔烃基团的胸苷类似物5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EDU），它在DNA复制过程中被整合到DNA中[1]。此外，末端炔烃基团的O6-苄基鸟嘌呤（PYBG）也被用于在细胞内标记SNAP标签融合蛋白[30]。EDU和PYBG的末端炔烃基团分别与探针CV-N3的叠氮基团进行CuAAC反应。在水中，CV-N3主要以红色荧光的激子形式存在。当与DNA或蛋白质共价结合时，激子解聚成绿色荧光的单体，产生明显的比率荧光信号。同时，DNA和蛋白质的微环境限制了CV-N3的分子内旋转，从而激活了其分子转子特性，实现了标记后的“无需洗涤”的荧光成像。（见图2。）
材料与仪器
所有试剂和化学品均为市售产品，无需进一步纯化即可使用。化合物的NMR光谱使用AVANCE NEO 600 MHz NMR光谱仪进行测量。LC-MS分析使用ISQEM-ESI（Thermo Fisher Scientific）仪器完成。UV–vis吸收光谱使用Cary 60 UV–vis光谱仪（Agilent）记录。荧光光谱使用Lumina荧光分光光度计（Thermo Fisher Scientific）获得。荧光成像使用LSM800设备完成。
CV-N3的设计和光谱特性
探针CV-N3的合成路线如图1所示，通过简单的Knoevenagel缩合反应后进行叠氮修饰实现。化合物的结构通过NMR和高分辨率质谱（HRMS）进行了表征（见图S1-S7）。
这些化合物在大多数溶剂中的吸收光谱相似，最大吸收波长在450–460纳米范围内（见图1a），相应的荧光发射峰位于500纳米左右。
结论
总结来说，我们开发了一种基于氰乙烯的荧光探针CV-N3，它通过激子解聚和微环境粘度激活的分子转子行为的双重机制发挥作用。时间分辨荧光寿命测量和DLS分析提供了直接证据，支持激子的形成及其通过CuAAC诱导的解聚。这种设计使得通过CuAAC点击反应能够对标记有炔烃的DNA和SNAP标签蛋白进行特异性共价标记。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号22174090）和陕西省自然科学基础研究计划（编号2024JC-YBMS-138）的支持。
