《Clinica Chimica Acta》：Determination of age-specific reference intervals for ethanolamine plasmalogen species in red blood cells using liquid chromatography tandem mass spectrometry
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本文针对临床实验室中缺乏对乙醇胺缩醛磷脂（PlsEtn）进行物种特异性定量及相应年龄特异性参考区间（RIs）的现状，报道了一项通过LC-MS/MS技术量化红细胞中18种PlsEtn物种的研究。研究人员通过模型聚类与Harris-Boyd迭代方法，首次基于健康人群（n=441）的年龄相关变化特征，建立了从出生到成年的精细年龄分层RIs。这项工作为缩醛磷脂临床检测方法的建立和多种神经退行性疾病的潜在生物标志物研究提供了关键的数据支撑。
缩醛磷脂（Plasmalogens），这类带有特征性乙烯醚键的甘油磷脂，是细胞膜不可或缺的组成部分，尤其在神经系统中含量丰富。它们不仅维持着细胞膜的结构，还在调控囊泡融合、神经递质释放以及抵抗氧化应激中扮演着关键角色。然而，缩醛磷脂的水平并非一成不变，其合成缺陷与多种严重的先天性疾病（如齐薇格谱系障碍ZSDs）密切相关，而其水平降低也已被发现与阿尔茨海默病、帕金森病等常见的神经退行性疾病以及衰老过程本身相关联。因此，准确检测体内缩醛磷脂的水平，对于这些疾病的诊断、预后评估乃至治疗监测都具有重要意义。
目前，临床实验室中用于评估缩醛磷脂的传统方法是气相色谱-质谱联用法（GC-MS）。但这种方法存在一个明显局限：在检测过程中，它会将结构各异的缩醛磷脂转化为二甲基缩醛（DMA），从而丢失了其在sn-2位点上所连接的不同多不饱和脂肪酸（如DHA、AA等）的物种特异性信息。这就好比将一幅多彩的油画变成了黑白照片，失去了关键的色彩细节。而能够精准识别和量化不同缩醛磷脂物种的液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）技术虽已发展，却因缺乏基于健康人群的大规模、跨年龄段的参考数据，迟迟难以在临床上广泛应用。医生拿到一个检测数值，往往无法判断它对于一个新生儿、一个儿童或一个成年人而言，究竟是正常、偏高还是偏低。这成为了将前沿的质谱技术转化为常规临床检测的一大瓶颈。为此，由Irene De Biase、Tatiana Yuzyuk等研究人员领衔的团队在《Clinica Chimica Acta》杂志上发表了一项关键研究，旨在填补这一空白。
本研究采用了已通过临床实验室完整验证的UPLC-MS/MS方法，对从浓缩红细胞（RBCs）中提取的18种最丰富的乙醇胺缩醛磷脂（PlsEtn）物种进行了绝对定量。研究共纳入了441份红细胞样本，这些样本来源于自我报告健康的志愿者以及因无关检测送检、结果正常的临床剩余样本，年龄覆盖从0天到88岁，确保了数据的代表性。为科学划分年龄组，研究者并未依赖传统的主观观察，而是创新性地采用了基于模型的聚类算法（R包Mclust）对“年龄-浓度”数据进行客观分析，初步识别出年龄相关的浓度集群。随后，通过迭代应用Harris-Boyd方法，对相邻集群的平均值进行比较与合并，最终确定了用于建立参考区间（RIs）的少数几个关键年龄分组。参考区间本身（95%区间，附带90%置信区间）则是基于最终年龄分组内的数据，根据分布的正态性，选用参数法或非参数法计算得出。
3.1. 浓缩红细胞中PlsEtn物种的相对丰度
研究首先分析了红细胞中不同PlsEtn物种的构成。结果发现，在sn-1位点携带硬脂酰基[18:0(plasm)]和棕榈酰基[16:0(plasm)]的PlsEtn占主导，平均分别占总量的50.3%和33.3%。在sn-2位点，富含omega-6花生四烯酸（AA）的PlsEtn物种最为丰富，约占总量的47.3%，其中18:0(plasm)-20:4 PE是浓度最高的单一物种。其次是携带二十二碳四烯酸（DTA）和二十二碳六烯酸（DHA）的物种。而含有油酸、亚油酸和二十碳五烯酸（EPA）的物种占比较小。此外，含有AA的PlsEtn其相对比例在个体间变异度很低，而含有DHA和EPA的物种比例则与年龄表现出适度的相关性。
3.2. PlsEtn浓度随时间的变化
这是研究的核心发现。通过散点图可视化和后续的统计分析，研究清晰地揭示了PlsEtn浓度随年龄的动态变化。大多数PlsEtn物种在新生儿期浓度最低，在儿童期升高并维持较高水平，到成年期后又有所下降，但不会降至新生儿期的低水平。有趣的是，携带DHA的PlsEtn物种（尤其是16:0(plasm)-22:6 PE）表现出截然不同的趋势：它们在出生时浓度最高，随后随时间推移而下降。这些变化大多在生命最初几个月内快速发生，青春期后则缓慢下降。这些发现直观地证实了建立年龄特异性参考区间的必要性。
3.3. 使用基于模型的聚类和迭代实施的Harris-Boyd方法识别年龄特异性分界点
为了客观、定量地划分年龄组，研究者应用了基于模型的聚类算法。该算法为每种分析物或总值平均识别出四个初始年龄集群（范围1-6个），生命最初的2-3个月对大多数PlsEtn而言都是一个独特的集群。例如，对于物种18:0(plasm)-22:6 PE，算法清晰地识别出了几个不同的浓度-年龄集群。随后，通过迭代应用Harris-Boyd方法比较相邻集群，最终将年龄分组简化为两到三个，为建立RIs奠定了基础。这一数据驱动的方法避免了主观划分的偏差。
3.4. 儿科和成人群体的红细胞PlsEtn参考区间
基于最终确定的年龄分组，研究分别使用参数或非参数统计，建立了18种PlsEtn单个物种、按其sn-1位点（16:0, 18:0, 18:1）分组的总和、按其sn-2位点分组的总和以及全部18种物种总和的年龄特异性RIs。这些区间精准地捕捉并量化了之前观察到的年龄相关趋势：对于大多数物种，生命最初2-3个月是一个独立的低浓度区间；儿童期的浓度通常高于成年期（≥18岁）。此外，研究还发现，在所有分析的PlsEtn物种或其总和中，男性与女性之间的浓度没有显著差异。
这项研究成功地利用LC-MS/MS这一先进技术，首次在涵盖从新生儿到老年的大规模健康人群队列中，建立了红细胞内18种主要乙醇胺缩醛磷脂（PlsEtn）物种的年龄特异性参考区间（RIs）。研究不仅证实了红细胞PlsEtn水平存在显著的年龄依赖性变化——大多数物种在新生儿期较低，在儿童期升高，成年后下降，而DHA-PlsEtn则在出生时最高随后下降——从而明确了为儿科和成人群体分别建立RIs的必要性，还通过创新的、数据驱动的模型聚类与Harris-Boyd迭代统计方法，科学地划分了年龄组，避免了主观性。
这项工作的意义重大而深远。首先，它直接解决了将LC-MS/MS缩醛磷脂检测技术转化为常规临床应用的瓶颈问题，为诊断过氧化物酶体生物合成障碍（如ZSDs、RCDP）提供了精确、物种特异的定量标准和“正常”参照。其次，所建立的大规模、跨年龄基线数据，为未来探索缩醛磷脂在阿尔茨海默病、帕金森病等常见神经退行性疾病中的作用，以及将其作为疾病生物标志物或Omega-3多不饱和脂肪酸摄入的生物标志物研究，奠定了坚实的数据基础。此外，该方法也能用于监测接受缩醛磷脂补充治疗（如使用合成前体PPI-1011）患者的疗效。尽管研究在样本获取（部分使用了临床剩余样本）和某些年龄段样本量上存在局限，但其采用的稳健统计方法和产生的详尽RIs数据，无疑将成为推动缩醛磷脂临床检测与相关研究领域发展的关键资源，支持这个快速发展的领域将磷脂异常与更广泛疾病联系起来。
