《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Bioinformatics based design of thermostable virus-like particles-based vaccine for foot-and-mouth disease serotype A and in-vivo evaluation in guinea pigs
编辑推荐：
为解决传统口蹄疫(FMD)灭活疫苗稳定性差、需冷链运输等问题，研究人员开展了针对FMDV A/IND/40/2000血清型的热稳定病毒样颗粒(VLPs)疫苗研究。通过生物信息学预测，在VP2和VP3蛋白上引入F62Y和H142D双突变(AM-3)，构建了热稳定VLPs。体外实验证实其在37°C存储后降解率显著降低，豚鼠攻毒实验显示其可提供90%的保护率。该研究为开发具有DIVA（区分感染与免疫动物）特性的新型热稳定FMD疫苗提供了重要候选。
口蹄疫，这个让全球畜牧业闻之色变的“头号传染病”，每年都会造成数百亿美元的经济损失。它是一种由口蹄疫病毒(FMDV)引起的、在偶蹄动物（如牛、猪、羊）中高度传染的疾病。目前，防控FMD主要依靠接种灭活病毒疫苗。然而，这种传统疫苗存在几大“硬伤”：免疫保护期短，需要频繁接种；疫苗生产必须在高等级生物安全实验室中进行，成本高昂；最关键的是，灭活疫苗无法区分动物体内的抗体是来自疫苗接种还是自然感染，这给疫病净化和国际贸易带来了巨大障碍。此外，传统疫苗中的病毒颗粒（146S抗原）对温度极为敏感，在非冷藏条件下极易分解失效，这使得疫苗从生产到接种的全程都必须依赖严格的“冷链”系统，这在基础设施薄弱的地区几乎是不可能完成的任务。
科学家们一直在寻找更安全、更稳定的疫苗替代品。病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)技术应运而生。VLPs是由病毒的结构蛋白自组装形成的空心颗粒，它们具有与真实病毒几乎一模一样的外壳，能高效激发免疫反应，但由于内部没有遗传物质，因此绝对安全，不会引发感染。更重要的是，基于VLPs的疫苗天然具备DIVA特性。但问题又来了：如何让这些精致的“仿病毒外壳”在常温下保持稳定，不再“娇气”呢？发表在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》上的这项研究，给出了一种巧妙的解决方案：利用生物信息学“计算”出能让病毒外壳更坚固的关键“零件”，并成功制造出了针对FMDV A型（印度流行株）的热稳定VLPs疫苗。
为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键的技术方法。首先是生物信息学分析与分子动力学模拟，他们以A22 Iraq毒株的晶体结构为模板，对目标毒株A/IND/40/2000的VP2和VP3蛋白进行同源建模，预测能增强颗粒间相互作用、提高稳定性的关键氨基酸位点，并通过计算结合自由能筛选最佳突变。其次是杆状病毒表达系统，利用该系统在昆虫细胞（Tn5细胞）中高效表达并组装野生型及突变型VLPs。第三是一系列体外表征与稳定性评估技术，包括透射电子显微镜(TEM)观察VLPs形态，夹心ELISA(S-ELISA)定量抗原并评估热稳定性，以及差示扫描荧光法(DSF)测定VLPs的解链温度(Tm)。最后是豚鼠体内免疫原性与保护效力评估，通过病毒中和试验(VNT)测定抗体水平，并用强毒进行攻毒实验，结合临床病变评分和非结构蛋白(NSP)阻断ELISA来综合评价疫苗的保护效果和DIVA特性。
研究结果部分详细展示了从设计到验证的全过程：
3.1 同源建模与分子动力学模拟：研究人员聚焦于病毒衣壳的五邻体间区域，筛选出VP2蛋白的F62、V90、H93、S97和VP3蛋白的H142等关键位点进行虚拟突变。计算结果显示，双突变体F62Y:H142D（命名为AM-3）的结合自由能最低，预示着其结构最稳定。分析表明，F62Y突变增加了与邻近蛋白的疏水相互作用，而H142D突变则减少了静电排斥，共同巩固了衣壳结构。
3.2 重组杆状病毒表达的VLPs表征：成功构建了包含8个预测突变体和1个野生型(A-WT)的重组杆状病毒，并在昆虫细胞中表达了相应的VLPs。S-ELISA证实所有突变体VLPs均具有良好的抗原性。Western blot检测到结构蛋白的正确表达和加工。透射电镜清晰地观察到了直径约25-30纳米的、形态完整的AM-3 VLPs颗粒，证实了病毒样颗粒的成功组装。
3.3 稳定性研究：这是验证设计成功与否的核心。在不同温度下的储存稳定性：将VLPs分别在37°C、24°C、4°C和-20°C下储存90天。结果显示，在最具挑战性的37°C条件下储存15天后，AM-3 VLPs的抗原降解率仅为62.5%，显著低于野生型VLPs（>80%），证明了其优异的热稳定性。高温暴露稳定性：将VLPs置于37°C、45°C和56°C下不同时间。在37°C下暴露4小时后，AM-3的抗原活性仍显著高于野生型和其他突变体。热变性分析：通过DSF测定VLPs的解链温度。在45°C处理30/60分钟后，AM-3的Tm值显著高于野生型，进一步从蛋白质折叠稳定性角度证实了其增强的热耐受性。
3.5 与 3.6 豚鼠免疫原性与保护效力研究：研究人员先在豚鼠中进行了AM-3 VLPs的剂量反应研究，确定12 μg/剂的剂量可提供完全保护。随后，将豚鼠分为四组，分别接种PBS、AM-3 VLPs、野生型VLPs和传统的灭活FMDV抗原。免疫反应：接种后56天，AM-3 VLPs组豚鼠的平均病毒中和抗体滴度与灭活抗原组相当，并显著高于野生型VLPs组。攻毒保护：用强毒攻击后，AM-3 VLPs组获得了90.9%的保护率（11只中10只保护），与灭活抗原组（100%保护）效果接近，而野生型VLPs组保护率仅为36.4%。DIVA特性验证：通过检测针对病毒非结构蛋白3AB的抗体，发现所有接种AM-3 VLPs或灭活抗原并受到保护的豚鼠，其3AB抗体均为阴性（PI值<40%），而所有未受保护的动物（包括PBS组和部分野生型VLPs组）均为阳性。这完美证明了VLPs疫苗可以实现感染与免疫的区分。
研究结论与讨论部分对全文工作进行了总结和展望。本研究成功运用生物信息学方法，针对FMDV A/IND/40/2000株，设计并验证了热稳定的VLPs疫苗候选株AM-3。其创新性在于将稳定化突变位点选在了五邻体间区域附近的VP2-F62和VP3-H142，而非此前报道的H3螺旋核心区，这为设计热稳定VLPs提供了新思路。AM-3 VLPs在体外表现出显著增强的热稳定性，在37°C下储存半月仍能保持大部分抗原完整性。更重要的是，在豚鼠模型中，AM-3 VLPs激发了高水平的保护性抗体，攻毒后提供90%的保护率，效果与传统灭活疫苗媲美，并天然具备DIVA特性。
这项研究的意义重大。首先，它展示了一种理性设计疫苗的新范式：从计算机预测到体外验证，再到体内功能确认。其次，研究成果直指当前FMD防控的痛点：热稳定性有助于降低对冷链的极端依赖，使疫苗能更经济、更可靠地送达资源有限地区的牧场；DIVA特性则为实施彻底的疫病净化、监测病毒循环以及恢复无疫区地位提供了关键技术工具，符合世界动物卫生组织关于FMD渐进控制路径的要求。尽管该研究目前仅在豚鼠模型中获得验证，且VLPs的生产效价、在牛等自然宿主中的免疫效果及细胞免疫应答等仍需进一步探索，但这项研究无疑为开发新一代安全、稳定、可用于区分免疫动物的口蹄疫疫苗奠定了坚实的基础，是向着最终控制和根除这一重大动物疫病迈出的关键一步。
