《Journal of Colloid and Interface Science》：Machine learning-assisted biosensor for microRNA analysis based on RCA-mediated hemin/G-quadruplex and thiol-functionalized red carbon dots
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肿瘤标志物miRNA let-7a的检测需求迫切，本研究开发了一种集成环滚动扩增（RCA）和红发射碳点（R-CDs）的无标记荧光生物传感器，通过硫醇基团氧化聚合实现荧光猝灭，检测限达0.16 fM，适用于资源有限地区的早期癌症诊断。
甘宁|方旺|张瑞燕|庄静云|丁凯欣|翁天欣|王秀峰|周婷|张国栋|张志清
中国石油大学（华东）化学与化学工程学院，青岛266580，中国
摘要
肿瘤生物标志物在癌症的早期检测中起着关键作用。因此，迫切需要快速、用户友好且精确的miRNA检测方法，以适应资源有限的环境。在这项研究中，开发了一种无标记荧光生物传感器，结合了滚环扩增（RCA）和红色发光碳点（R-CDs），用于超灵敏和特异性地识别miRNA let-7a。首先，合成了具有长波长发射的R-CDs，并通过酰胺化反应将其功能化为巯基。设计了一条模板链，其中包含与G-四聚体和miRNA let-7a互补的序列，以及一个特定的Nt.BbvCI切割酶识别位点。使用miRNA let-7a作为引物，启动了RCA过程。Nt.BbvCI酶触发了大量DNA片段的生成，这些片段随后作为引物启动新的RCA循环。生成的G-四聚体与血红素结合，形成具有过氧化物酶活性的DNA酶，将H?O?分解为羟基自由基（?OH）。这些自由基氧化了R-CDs上的巯基，形成二硫键（–S–S–），导致氧化聚集和荧光淬灭。该策略实现了0.16 fM的超低检测限。这种生物传感器结合了R-CDs、无标记方法和增强切割的RCA技术，在早期癌症诊断中具有巨大潜力。
引言
近年来，全球癌症发病率持续上升，已成为导致死亡的主要原因之一。每年有数百万人因此丧生[1]。因此，迫切需要有效的预防方法和早期诊断技术。微小RNA（miRNA）是一种约22个核苷酸长的非编码小RNA，能够有效调节基因表达，并对细胞分化、死亡和生长等重要生物现象产生重要影响[2]、[3]。大量研究表明，miRNA的异常翻译与各种癌症的发生和预后密切相关，使其成为癌症诊断和预防领域的关键生物标志物[4]、[5]、[6]。然而，实现敏感和区分性的miRNA检测一直是一项极其艰巨的任务。miRNA本身的表达水平极低，不同miRNA之间的序列同源性，其稳定性差，生物样本的复杂组成以及其中众多干扰物质，以及样本中相对较低的浓度，都给准确检测带来了许多困难[7]、[8]。尽管传统的定量检测方法在miRNA检测方面具有一定便利性，但它们也存在许多缺陷，如成本高昂、检测时间较长和灵敏度不足[9]、[10]。此外，在欠发达地区，技术资源短缺严重。当地实验室缺乏进行复杂测试的先进设备，技术更新缓慢，难以跟上miRNA检测的前沿，从而限制了检测的有效性和准确性。鉴于此，建立一种快速、高度选择性、灵敏、高效且经济的早期癌症生物标志物检测方法至关重要。
传统的检测方法存在一定的局限性。为了克服这些局限性，设计了多种生物传感器策略，如比色[11]、荧光[12]、[13]和电化学方法[14]来检测miRNA。其中，荧光生物传感器因其低成本和快速响应等优点，在生物医学领域得到了更广泛的应用[13]、[15]。除了传感策略外，信号元件对生物传感器的分析性能也至关重要。理想的荧光元件应具有优异的水溶性，能够在溶剂中均匀分散，发出明亮稳定的荧光（FL），并具有良好的生物相容性，以确保在生物系统中使用时不会产生不良影响。与金属量子点和有机染料等传统材料相比，碳点（CDs）在荧光分析领域显示出显著的应用潜力，因为它们具有优异的稳定性、良好的生物相容性和低毒性[16]、[17]。例如，Wang等人[12]制备了具有两亲行为的氟掺杂碳点，可以通过疏水相互作用可逆地吸附DNA，并基于此构建用于检测miRNA的探针。Xia等人[18]开发了一种新型的比率型荧光生物传感器，基于CDs和吖啶衍生物，旨在检测外泌体miRNA。然而，大多数现有碳点的荧光发射波长相对较短（<600 nm），这使得它们在检测过程中容易受到背景荧光的干扰[12]、[18]、[19]。此外，在生物应用中，短波长导致碳点的渗透能力不足，从而限制了其进一步的应用。红色碳点（R-CDs）可以在一定程度上缓解这些问题，但大多数现有R-CDs的合成和加工步骤相对复杂[20]、[21]。因此，开发易于处理的红色荧光CDs尤为重要。
此外，miRNA生物传感器在实际应用中面临一个主要挑战，即样本中miRNA的含量极低。为了提高检测灵敏度，必须使用扩增技术。目前，已在miRNA生物传感器中实施了多种扩增策略，包括但不限于杂交链反应（HCR）、交叉引物等温扩增（CPA）和实时聚合酶链反应（RT-PCR）[22]、[23]、[24]。在这些扩增策略中，滚环扩增（RCA）作为一种极具吸引力的等温扩增方法脱颖而出。它作为一种连续复制机制，能够不断复制与环状模板互补的大量DNA链，从而显著提高检测灵敏度[25]。因此，RCA在生物检测扩增领域得到了广泛应用[15]、[25]。然而，将这种扩增的目标转化为可靠的信号读出仍然至关重要。尽管传统的比色底物（如3,3′,5,5′-四甲基联苯胺）被广泛使用，但它们固有的低灵敏度和对复杂样本中浊度干扰的高敏感性使其不适合检测微量生物标志物。为了克服这些限制，引入表面功能化的荧光材料（如CDs）是一种有效的策略。虽然用特定反应基团修饰材料会略微增加制备复杂性，但可以显著提高传感系统的灵敏度和抗干扰能力，这一概念在最近的高级生物传感研究中得到了广泛验证[26]、[27]、[28]。迄今为止，很少有miRNA荧光探针将RCA的强大扩增能力与R-CDs的优异光学性能结合起来。因此，结合两者的优势来构建新型生物传感器具有巨大的潜力，并为早期癌症诊断带来了广阔的发展前景。
受先前研究的启发，我们提出了一种高灵敏度的荧光检测方法，将表面改性的R-CDs与RCA技术结合用于miRNA分析。具体而言，通过一步水热法合成了R-CDs（方案1）。这些R-CDs表现出优异的光稳定性和生物相容性，并发出长波长荧光。随后，用3-巯基丙酸（MA）对R-CDs进行功能化，得到巯基修饰的R-CDs（R-CDs-SH），它们保持明亮的红色荧光。在这项研究中，这些巯基化的R-CDs作为检测探针。血红素/G-四聚体复合物作为DNA酶，催化过氧化氢（H?O?）的分解，生成羟基自由基（?OH）。这些自由基氧化R-CDs上的巯基，形成二硫键，引发R-CDs聚集和随后的荧光淬灭。在这个传感系统中，目标miRNA作为引物启动RCA反应。在扩增过程中，产物同时被切割酶切割，生成大量的G-四聚体。这种二次扩增使得能够检测微量miRNA。值得注意的是，需要特定的目标引物来启动RCA，确保了高选择性。这项工作结合了碳点、无标记策略和RCA技术的优势，实现了miRNA的超灵敏量化，显示出早期癌症诊断的巨大潜力。
材料
3-溴-1,2-二氨基苯（BBD）、4-氨基乙酰苯胺（AT）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、MA、血红素、过氧化氢（H?O?）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、氨基酸和其他金属盐均购自Macklin（上海，中国）。所有寡核苷酸的合成（表S1）由南京基因斯克科技有限公司完成。细胞培养基和胎牛血清（FBS）来自Thermo Fisher Scientific。其余所有
miRNA let-7a生物传感原理
基于R-CDs-SH检测miRNA let-7a的基本原理如图1所示。首先，通过水热法制备R-CDs，然后通过酰胺化反应引入巯基，得到R-CDs-SH（图1A）。由于巯基容易被羟基自由基氧化形成二硫键，这导致R-CDs聚集并伴随荧光淬灭。接下来，设计了一条线性环状模板链（图1B）。
结论
总之，通过水热法成功合成了R-CDs，并开发了一种无标记荧光生物传感器，结合机器学习算法用于微量肿瘤生物标志物miRNA let-7a的检测。通过酰胺化反应将巯基（-SH）策略性地引入R-CDs表面。利用巯基容易被羟基自由基氧化的特性，目标miRNA let-7a触发了RCA反应，生成
CRediT作者贡献声明
甘宁：撰写——原始草案、验证、软件、方法学、研究、概念化。方旺：撰写——审阅与编辑、监督、方法学。张瑞燕：方法学。庄静云：方法学。丁凯欣：方法学。翁天欣：方法学。王秀峰：项目管理。周婷：项目管理。张国栋：数据管理。张志清：撰写——审阅与编辑、监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了山东省自然科学基金（ZR2022MB148和ZR2023MB148）和中央高校基本科研业务费（22CX03024A、23CX03005A和23CX03006A）以及研究生教育改革项目（SDYAL2024044和YJG2023023）的支持。
