《Clinical and Translational Medicine》：ZFP36L1 promotes non-small cell lung cancer progression under hypoxia by modulating CXCL9:SPP1 polarity: A single-cell transcriptomic study
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本研究为克服非小细胞肺癌（NSCLC）中由耐药性和免疫逃逸导致的治疗困境，聚焦肿瘤微环境内巨噬细胞极化失衡的关键机制。研究人员通过单细胞转录组学分析和多维度功能实验，系统揭示了转录因子ZFP36L1在缺氧条件下如何转录上调促癌基因SPP1，从而打破巨噬细胞抗肿瘤表型（CXCL9+）与促癌表型（SPP1+）的平衡，最终通过SPP1-CD44轴加速NSCLC进展。该研究不仅阐明了缺氧诱导免疫抑制微环境的新通路，也为靶向巨噬细胞极化以改善NSCLC免疫治疗提供了潜在新靶点。
肺癌是全球健康的主要威胁之一，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占据了近85%的病例。尽管化疗、靶向治疗和免疫疗法不断进步，但耐药性和肿瘤微环境介导的免疫逃逸仍是临床上面临的巨大挑战。肿瘤微环境如同一个复杂的“生态系统”，其中的免疫细胞，特别是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），扮演着双重角色：既能抗肿瘤，也能助纣为虐，促进肿瘤生长和转移。近年来的研究发现，巨噬细胞并非铁板一块，它们可以根据表达的特定分子“改旗易帜”。其中，表达CXCL9的巨噬细胞倾向于发挥抗肿瘤作用，而表达SPP1（骨桥蛋白）的巨噬细胞则与肿瘤进展和不良预后密切相关。这两类巨噬细胞的比例（CXCL9:SPP1比）像一个关键的“天平”，其倾斜方向深刻影响着肿瘤的命运。然而，在NSCLC缺氧的肿瘤微环境中，是谁在幕后操纵这个“天平”的失衡？其具体的分子机制又是怎样的？这些问题尚未得到清晰解答。发表在《Clinical and Translational Medicine》的这项研究，正是为了揭开这个谜团。
为了探索这一问题，研究团队运用了多种前沿技术。首先，他们通过对公共数据库GSE148071（26例晚期NSCLC样本）和GSE131907（4例正常肺组织样本）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行深度生物信息学分析，描绘了NSCLC微环境的细胞图谱，并精准鉴定出SPP1+和CXCL9+的TAM亚群。在实验验证方面，研究利用人单核细胞系THP-1诱导的M0巨噬细胞，在体外模拟缺氧（1% O2）条件，通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光、流式细胞术和ELISA等技术，系统评估了缺氧对巨噬细胞表型及细胞因子分泌的影响。为了揭示ZFP36L1对SPP1的调控关系，研究者采用了染色质免疫共沉淀（ChIP）和双荧光素酶报告基因实验。功能研究则通过建立巨噬细胞与NSCLC细胞系（A549, NCI-H2170）的共培养体系，结合CCK-8、Transwell、克隆形成、划痕实验和流式细胞术检测细胞凋亡，评估了巨噬细胞极化对肿瘤细胞恶性行为的影响。为了增强临床相关性，研究还构建了NSCLC患者来源的类器官，并将其与巨噬细胞共培养，通过H&E染色、EdU染色和CellTiter-Glo活力检测来评估病理变化、增殖和活力。最后，研究团队构建了巨噬细胞特异性ZFP36L1基因敲除小鼠模型，通过皮下接种Lewis肺癌细胞，在体内验证了ZFP36L1在调控CXCL9:SPP1极性和NSCLC进展中的关键作用。
3.1 基于单细胞数据集的NSCLC巨噬细胞CXCL9:SPP1比例分析
通过对单细胞转录组数据的分析，研究成功鉴定了NSCLC肿瘤微环境中的13种主要细胞类型。进一步聚焦巨噬细胞，研究者发现肿瘤相关巨噬细胞具有显著的异质性，并可以划分为三个亚群：SPP1+TAM、CXCL9+TAM和CPM+TAM，其中SPP1+TAM占比最高，提示其在促肿瘤微环境中可能占主导地位。
3.2 缺氧降低巨噬细胞CXCL9:SPP1比例并促进NSCLC进展
实验证实，缺氧处理能显著抑制巨噬细胞中CXCL9的表达，同时上调SPP1的mRNA和蛋白水平，导致CXCL9+/SPP1+巨噬细胞比例下降，即CXCL9:SPP1比值降低。同时，缺氧巨噬细胞分泌的细胞因子谱也向促炎、促癌方向转变（IL-7、CXCL10减少，IL-1β、CXCL5增加）。更重要的是，当将缺氧处理的巨噬细胞与NSCLC细胞共培养时，肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著增强，而凋亡受到抑制。这直接证明了缺氧通过重塑巨噬细胞表型平衡来驱动肿瘤进展。
3.3 ZFP36L1是调控巨噬细胞CXCL9:SPP1比例的关键基因
通过生物信息学筛选和实验验证，研究锁定转录因子ZFP36L1为关键调控因子。在缺氧条件下，巨噬细胞中ZFP36L1表达上调。临床样本分析显示，ZFP36L1高表达与患者不良预后相关，且与SPP1表达呈正相关。功能获得和缺失实验证明，ZFP36L1的上调能促进SPP1表达、抑制CXCL9表达，从而降低CXCL9:SPP1比值；而敲低ZFP36L1则产生相反效果。机制上，ChIP和双荧光素酶报告基因实验证实ZFP36L1能直接结合并转录激活SPP1的启动子。
3.4 ZFP36L1介导的巨噬细胞CXCL9:SPP1比例调控影响NSCLC进展
通过基因操作（过表达ZFP36L1和敲低SPP1），研究者在共培养体系中证实，ZFP36L1通过上调SPP1来促进巨噬细胞的促肿瘤表型，进而增强NSCLC细胞的恶性行为。使用SPP1单克隆抗体可以逆转ZFP36L1过表达带来的促癌效应。在更贴近临床的巨噬细胞-患者来源类器官共培养模型中，同样验证了ZFP36L1-SPP1轴在促进类器官增殖、活力并抑制其凋亡方面的关键作用。
3.5 ZFP36L1驱动的SPP1+TAM通过靶向肿瘤细胞表面CD44加速NSCLC进展
细胞间通讯分析提示，SPP1+TAM作为信号发送者，其配体SPP1可能通过结合受体CD44与肿瘤细胞相互作用。临床样本免疫组化和免疫荧光显示SPP1与CD44表达呈正相关。在功能实验中，在共培养体系中加入CD44单克隆抗体，可以有效抑制由ZFP36L1过表达所引发的肿瘤细胞增殖、迁移侵袭增强及凋亡抑制。这表明ZFP36L1驱动的SPP1+TAM主要是通过SPP1-CD44相互作用来施加其促癌影响。
3.6 在体内，巨噬细胞中敲除ZFP36L1通过平衡CXCL9:SPP1比例抑制NSCLC进展
最后，研究利用巨噬细胞特异性ZFP36L1敲除小鼠模型进行了体内验证。与野生型小鼠相比，ZFP36L1敲除小鼠的肿瘤生长（体积和重量）显著减缓。肿瘤组织分析显示，敲除ZFP36L1后，肿瘤内SPP1和增殖标志物Ki67表达下降，而CXCL9表达上升，肿瘤微环境中的细胞因子谱也向抗肿瘤方向偏移。这从在体水平完整证实了巨噬细胞ZFP36L1在调控CXCL9:SPP1平衡和促进NSCLC进展中的核心作用。
归纳研究结论和讨论部分
本研究系统性地揭示了一条缺氧驱动NSCLC免疫微环境重塑和肿瘤进展的新通路：在缺氧的肿瘤微环境中，巨噬细胞内的转录因子ZFP36L1表达上调；ZFP36L1直接转录激活促癌基因SPP1，导致巨噬细胞极化向SPP1+促癌表型倾斜，同时抑制抗肿瘤的CXCL9+表型，从而打破CXCL9:SPP1的比例平衡；进而，SPP1+巨噬细胞通过分泌的SPP1蛋白与肿瘤细胞表面的CD44受体结合，最终加速NSCLC的恶性进展。这一发现具有多重重要意义。首先，它首次明确了ZFP36L1在NSCLC缺氧微环境中对巨噬细胞极化的关键调控作用，为理解肿瘤免疫抑制微环境的形成提供了新的分子视角。其次，研究将缺氧、特定转录因子、巨噬细胞表型转换和肿瘤细胞受体激活串联成一个清晰的信号轴（缺氧-ZFP36L1-SPP1-CD44），阐明了跨细胞作用的完整机制。最后，也是最关键的，ZFP36L1和SPP1-CD44轴被确定为潜在的、可干预的治疗靶点。针对ZFP36L1或其下游的SPP1-CD44相互作用进行阻断，有望将促癌的巨噬细胞“重编程”为抗肿瘤状态，从而逆转免疫抑制微环境，为改善NSCLC的免疫治疗疗效提供了新的策略和理论依据。尽管研究存在样本量等局限性，但其整合单细胞图谱、多维度功能实验和体内外模型的系统性工作，坚实论证了这一新机制，为后续的转化研究和药物开发指明了方向。
