《European Journal of Immunology》：Depletion of Neonatal Neutrophilic Cells Worsens the Outcome of E. coli Sepsis in Newborn Mice
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本研究聚焦新生儿脓毒症高发病率和死亡率的问题，探讨了具有免疫抑制特性的新生儿中性粒细胞在其中的作用。研究人员通过建立新生小鼠大肠杆菌脓毒症模型，并使用抗Ly6G抗体耗竭中性粒细胞，发现耗竭后小鼠死亡率显著升高，全身性炎症加剧，而细菌载量仅轻微增加，揭示了新生儿中性粒细胞通过控制炎症发挥保护作用的新机制，为治疗提供了潜在靶点。
每个呱呱坠地的新生儿，尤其是早产儿，都面临着比成年人高得多的感染风险，其中脓毒症是新生儿期发病和死亡的主要原因之一。为什么小宝宝们的免疫系统表现得如此“脆弱”？这背后，作为第一道防线的主力军——中性粒细胞的行为差异，成为了科学家们关注的焦点。成人和新生儿的中性粒细胞在功能上存在显著不同，新生儿的中性粒细胞（NNC）不仅存在促炎反应功能缺陷，其群体中还混杂着一类具有免疫抑制作用的细胞，即粒细胞样骨髓源性抑制细胞（GR-MDSC）。这群特殊的细胞在胎儿和新生儿时期生理性扩增，它们既可能抑制免疫反应、增加感染易感性，又可能在建立新生儿肠道菌群时抑制过度炎症，起到保护作用。那么，在新生儿遭遇致命感染如脓毒症时，NNC群体中这种相互矛盾的促炎与抗炎属性，到底谁占主导？它们的净效应是帮助清除细菌，还是会抑制免疫导致病情恶化，抑或是通过控制炎症来保护宿主？为了解答这个关键谜题，来自德国蒂宾根大学医院等机构的研究团队在《European Journal of Immunology》上发表了一项研究，他们深入探究了NNC在新生小鼠大肠杆菌脓毒症模型中的具体角色。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，他们建立了一个标准化的新生小鼠（出生后第2天，P2）大肠杆菌K1菌株皮下注射脓毒症模型，通过调整细菌剂量（菌落形成单位，CFU）和窝产仔数，确定了可产生稳定死亡率的实验条件。其次，他们利用特异性抗体（抗Ly6G抗体）在脓毒症诱导前对新生小鼠进行腹腔注射，实现了对表达Ly6G的NNC的有效耗竭，以对照同型抗体处理的动物作为对照。再者，研究采用了流式细胞术这一核心工具，对脓毒症后小鼠脾脏、肝脏、肺脏等器官中的免疫细胞（包括NNC、T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞等）进行了精细的定量和表型分析，并检测了细胞内细胞因子（如IL-1β、MCP-1）的表达。此外，团队通过体外功能实验比较了从新生儿和成年小鼠脾脏分离的中性粒细胞在活性氧（ROS）产生、细菌吞噬以及抑制CD4+T细胞增殖能力方面的差异。最后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了小鼠血清中关键促炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的水平，并通过在琼脂平板上培养并计数菌落的方法，量化了各器官和体液中的细菌载量。
3.1 建立新生小鼠大肠杆菌脓毒症模型
研究人员首先致力于建立一个生存率约为50%的新生小鼠脓毒症模型。他们发现，在出生后第2天（P2）进行感染比在第8天（P8）导致更高的死亡率。窝产仔数对生存有显著影响，来自小型窝（5-6只）的幼鼠比来自大型窝（8-9只）的幼鼠生存率更高，尽管大型窝的幼鼠体重更高。最终确定使用P2、来自5-6只幼鼠的小型窝、皮下注射30,000 CFU大肠杆菌作为标准模型，可获得约67%的生存率。
3.2 新生儿脓毒症导致显著的中性粒细胞减少
通过流式细胞术分析，研究人员比较了成年和新生小鼠在脓毒症前后各器官中的中性粒细胞（定义为CD11b+/Gr-1+细胞）数量。结果显示，在无脓毒症时，新生小鼠各器官中的中性粒细胞比例显著高于成年小鼠。然而，在诱导脓毒症后，成年小鼠的肝脏和肺部出现了显著的中性粒细胞浸润，而新生小鼠在所有被检测的器官（脾脏、肝脏、肺部）中均出现了显著的中性粒细胞减少，即“中性粒细胞减少症”。
3.3 NNC和ANC的功能特性不同
接下来，研究人员在体外比较了从成年和新生小鼠脾脏分离的中性粒细胞（定义为CD11b+/Ly6G+细胞）的功能。他们发现，NNC和ANC在产生活性氧（ROS）和吞噬大肠杆菌的能力上没有差异。然而，关键的区别在于，NNC表现出强大的抑制CD4+T细胞增殖的能力，而ANC则没有这种抑制作用。此外，在经大肠杆菌刺激后，NNC比ANC诱导产生了更多的促炎细胞因子IL-1β和MCP-1，而TNF-α的诱导水平相似，IL-6则无变化。
3.4 耗竭表达Ly6G的NNC导致新生小鼠脓毒症死亡率增加
为了探究NNC在脓毒症进展中的作用，研究人员在出生后第1天（P1）使用抗Ly6G抗体耗竭了新生小鼠的NNC，并于P2诱导脓毒症。抗体处理有效地减少了脾脏中的Ly6G+细胞，且这种耗竭效应可持续至少7天。与接受同型对照抗体的小鼠相比，NNC耗竭组小鼠在接种低剂量（10,000 CFU）和高剂量（30,000 CFU）大肠杆菌后，生存率均显著降低。
3.5 NNC耗竭后新生小鼠脓毒症的细菌载量和炎症增加
进一步分析显示，在使用低剂量细菌感染时，NNC耗竭组小鼠的脾脏和肺部细菌载量显著高于对照组。但在高剂量感染或其他器官中，细菌载量差异不显著。值得注意的是，无论感染剂量高低，NNC耗竭组小鼠血清中的促炎细胞因子IL-6和MCP-1水平均显著高于对照组，表明全身性炎症反应加剧。
3.6 耗竭表达Ly6G的NNC对脓毒症期间免疫细胞群的影响
尽管NNC耗竭导致了更差的结局，但研究人员发现，它对脓毒症期间脾脏和肝脏中主要的免疫细胞群（如T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞）的比例影响甚微。脓毒症本身会引起巨噬细胞和树突状细胞的减少以及单核细胞的增加，但NNC耗竭并未显著改变这些主要淋巴细胞群体的组成。
研究结论与意义
本研究通过综合运用体内模型、细胞耗竭和体外功能分析，得出了明确而重要的结论：新生儿中性粒细胞（NNC）在新生小鼠大肠杆菌脓毒症中扮演着保护性角色。尽管NNC在清除细菌（抗感染）方面的直接能力可能有限（细菌载量仅轻微受影响），但它们通过其强大的免疫抑制特性（特别是抑制T细胞增殖和控制促炎细胞因子产生），有效地调控了感染引发的全身性炎症反应。耗竭NNC导致死亡率升高，主要与失控的炎症反应（“细胞因子风暴”）相关，而非单纯的细菌负荷增加。这强有力地表明，新生儿体内这个特殊的、富含粒细胞样骨髓源性抑制细胞（GR-MDSC）的中性粒细胞群体，其净效应是抗炎的，它们像“炎症刹车”一样，保护新生儿免受脓毒症中致命性过度炎症的损害。
这项研究的意义重大。首先，它深化了对新生儿免疫系统独特性的理解，特别是阐明了NNC/GR-MDSC在生命早期感染免疫中的关键调节作用，为解决“新生儿感染易感性悖论”提供了新的细胞和机制视角。其次，研究结果挑战了单纯增强免疫反应来对抗新生儿脓毒症的传统思路，提示调控炎症而非仅仅杀菌可能是一个更有效的治疗策略。针对NNC免疫抑制功能的药物，可能成为治疗新生儿脓毒症、防止多器官衰竭的新途径。然而，研究也指出了当前面临的挑战：由于GR-MDSC与成熟中性粒细胞在表型上难以区分，实现对其特异性靶向而非耗竭全部中性粒细胞，是未来转化医学需要攻克的技术难题。总之，这项工作不仅揭示了新生儿脓毒症病理生理的新环节，也为开发基于免疫调节的精准治疗策略奠定了重要的理论基础。
